Nuevos polimorfismos de un único nucleótido y combinaciones de polimorfismos nuevos y conocidos para determinar la expresión específica de alelo del gen IGF2.

Un método para cuantificar la expresión específica de alelo de ARN en un individuo humano que es un heterocigoto para un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en el gen del Factor de Crecimiento de Insulina 2 (IGF2),

comprendiendo el método

cuantificar en una muestra del individuo la cantidad de ARN que comprende cada opción polimórfica del SNP, donde el SNP es SEC ID Nº: 16; y

correlacionar la cantidad relativa de ARN que comprende cada opción polimórfica del SNP con pérdida de impronta del gen IGF2.

Nuevos polimorfismos de un único nucleótido y combinaciones de polimorfismos nuevos y conocidos para determinar la expresión específica de alelo del gen IGF2 5

Antecedentes de la invención El gen para el factor de crecimiento de tipo insulina 2, o IGF2, se localiza en un grupo de genes impresos en el cromosoma humano 11p15.5. La impronta genómica es un mecanismo importante de regulación génica en el que una copia del gen normalmente se expresa y la otra copia se silencia mediante una marca epigenética de origen parental. IGF2 normalmente tiene impronta materna en tejidos humanos y por lo tanto se expresa solamente de la copia heredada por vía paterna del gen (DeChiara TM, et al. Cell 64, 849-859 (1991) ; Rainier S, et al., Nature 362, 747-749 (1993) ; Ogawa, et al, Nature 362, 749-751 (1993) ) . La pérdida de impronta de IGF2 (denominada pérdida de impronta o LOI) se ha ligado fuertemente con varios tipos de cáncer (más de 20 tipos tumorales revisados en Falls, et al. 1999, AJP 154, 635-647) . Además, pruebas crecientes indican que los individuos que presentan LOI de IGF2 pueden tener un riesgo elevado de desarrollar cáncer colorrectal (Kinochi et al., 1996, Cancer Letters 107, 105108 (1996) ; Nishihara S. 2000, Int. Jour. Oncol. 17, 317-322; Cui H 1998, Nature Medicine 4-11, 1276-1280; Nakagawa H 2001, PNAS 98-2, 591-596) . La LOI de IGF2 puede detectarse en tejidos normales de pacientes con cáncer incluyendo sangre periférica y mucosa colónica normal (Kinochi et al., 1996, Cancer Letters 107, 105-108 (1996) ; Ogawa, et al, Nature Genetics 5, 408-412 (1993) ; Cui H, Science 299, 1753 (2003) ) y en los tejidos normales de personas que se cree que no tienen cáncer (Cui H, et al. Nature Medicine 4-11, 1276-1280 (1998) ; Cui H, Science 299, 1753 (2003) ; Woodson K et al., JNCI 96, 407-410 (2004) ; Cruz-Correa Met al., Gastroenterology 126, 964-970 (2004) ) .

Varios estudios de sangre periférica de poblaciones generales indican que entre el 7 y 10 % de las personas presentan pérdida de impronta de IGF2 en tejido de mucosa colónica. Tres estudios retrospectivos indican que las probabilidades de que pacientes con cáncer colorrectal presenten LOI de IGF2 en sangre periférica o mucosa colónica son significativamente mayores (entre 2-21 veces) que las probabilidades de que un grupo de control sin cáncer de la misma edad presente LOI. Estos estudios sugieren que la LOI de IGF2 puede predisponer a individuos sanos en lo demás a cáncer colorrectal. Por lo tanto, un ensayo de riesgo basado en la detección de LOI de IGF2 puede tener un beneficio clínico futuro (Cui H, et al. Nature Medicine 4-11, 1276-1280 (1998) ; Cui H, Science 14, 1753-1755 (2003) ; Woodson K 2004, JNCI 96, 407-410; Cruz-Correa M, Gastroenterology 126, 964-970 (2004) ) . Estos estudios muestran que las personas con LOI de IGF2 (también denominado el biomarcador IGF2) pueden tener hasta 20 veces más probabilidades de desarrollar cáncer colorrectal que los individuos sin el biomarcador

IGF2.

La detección de LOI de IGF2 se basa en un ensayo de expresión génica específico de alelo cuantitativo, en el que se cuantifican los transcritos de cada una de ambas copias del gen IGF2. Después se comparan las cantidades entre sí para determinar una relación de expresión génica alélica, que se compara posteriormente con un valor umbral. Si la concentración del alelo menos abundante es “relativamente similar” a la concentración del alelo más abundante, entonces se determina que la impronta de IGF2 se ha perdido. Si la concentración del alelo menos abundante es “relativamente diferente” a la concentración del alelo más abundante, entonces se determina que la impronta de IGF2 está presente. Un método para medir el estado de impronta de IGF2 en una muestra es determinar en primer lugar el genotipo o los genotipos de uno o más sitios polimórficos en la región transcrita del gen 45 IGF2. Los marcadores heterocigotos en la región transcrita del gen proporcionan indicios moleculares convenientes por los que pueden distinguirse los alelos individuales del gen IGF2 entre sí en una muestra. La transcripción de ARN de cada una de las dos copias del gen IGF2 puede medirse independientemente con ensayos específicos de alelos cuantitativos. Por lo tanto puede realizarse una comparación de la cantidad de expresión de un alelo con la cantidad de expresión de otro alelo y puede determinarse el estado de impronta del gen IGF2 (véase Figura 2) .

IGF2 tiene cuatro promotores, que conducen cada uno expresión de transcritos de corte y empalme alternativo, de una manera específica de tejido (Figura 1A) . Los exones 7, 8 y 9 están presentes en todos los transcritos, mientras que se ha indicado los exones 1-6 se expresan de una manera específica de promotor. El exón 9 incluye un tramo corto de secuencia codificante de proteínas seguida de una 3’ UTR considerablemente más larga. Los marcadores 55 polimórficos en los exones 7, 8 y 9 son por lo tanto útiles en la determinación del estado de impronta de IGF2 permitiendo la detección de expresión específica de alelos de la transcripción de IGF2 conducida desde cualquiera de los cuatro promotores de IGF2.

Los expertos en la materia conocen cuatros ensayos de expresión específicos de alelo que miden el estado de impronta de IGF2. Woodson, et al. midieron el estado de impronta de IGF2 con una combinación de dos ensayos basados en SNP (rs680 – análogo de SEC ID Nº: 64 en la Tabla 1A; y rs2230949 -análogo de SEC ID Nº: 56 en la Tabla 1A) (Woodson K 2004, JNCI 96, 407-410) . Ambos SNP están en el exón 9 de IGF2 pero se indica por Woodson et al. que están en desequilibrio de enlace mínimo. Por lo tanto, los intentos de medir la LOI de un individuo con dicha combinación de marcadores aumenta la probabilidad de que el individuo sea heterocigoto para al 65 menos uno de los dos SNP, y por lo tanto aumenta la probabilidad de que pueda determinarse el estado de LOI del individuo. Los autores demostraron que el primer SNP, el segundo SNP o ambos SNP eran informativos (es decir,

eran heterocigotos y, por lo tanto, permitían la medición de LOI de IGF2) en 48 de 106 pacientes evaluados (o 45 %) . Cui et al. midieron la impronta de IGF2 con una combinación de dos ensayos, uno que se dirigía a un SNP (rs680 -análogo de SEC ID Nº: 64 en la Tabla 1A) y un segundo que medía polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción de una repetición de secuencia sencilla dentro del exón 9 de IGF2. Los autores demostraron que el

SNP, la repetición o ambos marcadores eran informativos en 191 de 421 (o 45 %) pacientes evaluados (Cui H, et al. Nature Medicine 4-11, 1276-1280 (1998) ) .

Estudios previos han demostrado que el uso de estos polimorfismos da como resultado una frecuencia combinada baja de heterocigosidad en poblaciones de pacientes y, por lo tanto, un gran número de individuos en estas poblaciones eran “no informativos” de modo que no pudo determinarse su estado de impronta de IGF2. La presente solicitud describe SNP de nuevo descubrimiento en el exón 9 de IGF2, y descubrimiento de combinaciones útiles de SNP que permiten mediciones de LOI exitosas en una proporción aumentada de la población humana. La capacidad para medir LOI usando esos polimorfismos en la población en general tendrá un profundo beneficio médico, actuando como la base de diversos ensayos de diagnóstico y terapéuticos moleculares.

La capacidad informativa de un SNP dado para la detección de LOI se basa en la frecuencia de heterocigosidad del SNP dentro de una población. Además, la capacidad informativa óptima de una combinación de diferentes SNP depende del enlace entre los diferentes marcadores. Por ejemplo, si dos SNP quedan dentro de un bloque de haplotipo común, el uso combinado de los dos SNP proporciona un aumento mínimo de la capacidad informativa en relación con el uso de cada uno de los dos SNP por sí solo. Sin embargo, si dos SNP no están en el mismo bloque de haplotipo (es decir, están en un desequilibrio de enlace mínimo) , el uso combinado de los dos SNP proporciona un aumento efectivo de la capacidad informativa en relación con el uso de cada uno de los dos SNP por sí solo.

La reciente publicación del conjunto de datos de variación genética humana HapMap II proporciona análisis de haplotipo de datos de secuencias de ADN de todo el genoma. En el estudio HapMap II, se identificaron SNP en 270 personas genotipadas de cuatro poblaciones geográficamente diversas, incluyendo 30 tríos de madre-padre-hijo adulto de los Yoruba en Ibadan, Nigeria; 30 de dichos tríos de origen europeo septentrional y occidental que vivían en Utah; individuos chinos Han no relacionados en Pekín y 45 individuos japoneses no relacionados en Tokio. El... [Seguir leyendo]

1. Un método para cuantificar la expresión específica de alelo de ARN en un individuo humano que es un heterocigoto para un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en el gen del Factor de Crecimiento de Insulina 2 5 (IGF2) , comprendiendo el método cuantificar en una muestra del individuo la cantidad de ARN que comprende cada opción polimórfica del SNP, donde el SNP es SEC ID Nº: 16; y correlacionar la cantidad relativa de ARN que comprende cada opción polimórfica del SNP con pérdida de impronta del gen IGF2.

2. El método de la reivindicación 1, donde la etapa de correlación comprende correlacionar la cantidad relativa de ARN con un pronóstico o diagnóstico de cáncer o una predicción de la eficacia de un fármaco para tratar el cáncer.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además determinar si el individuo es homocigoto o heterocigoto para el SNP.

4. Un método para determinar un genotipo de SNP en un individuo humano, comprendiendo el método determinar, en una muestra que contiene ADN genómico del individuo, el nucleótido o los nucleótidos en la posición polimórfica de un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) , donde el SNP es SEC ID Nº: 16 y donde el nucleótido es el nucleótido subrayado como se presenta en la Tabla 2A.

5. Un polinucleótido aislado de entre 8-100 nucleótidos, donde el polinucleótido distingue entre un alelo de un SNP

(o complemento del mismo) y el otro alelo del SNP (o complemento del mismo) en una reacción de hibridación, donde el SNP es SEC ID Nº: 16.

6. El polinucleótido de la reivindicación 5, donde el penúltimo o último nucleótido 3’ del polinucleótido hibrida con el

nucleótido polimórfico del SNP. 30

7. Un polinucleótido aislado de entre 8-100 nucleótidos donde el polinucleótido actúa como un cebador en ADNc de Factor de Crecimiento de tipo Insulina 2 (IGF2) , de modo que el polinucleótido hibride con el ADNc y el nucleótido 3’ del polinucleótido sea complementario del nucleótido inmediatamente cadena arriba del nucleótido polimórfico de un SNP, donde el SNP es SEC ID Nº: 16.

8. El polinucleótido de la reivindicación 7, donde al menos los 10 nucleótidos 3’ contiguos del polinucleótido son complementarios del ADNc.

9. Un polinucleótido aislado que comprende SEC ID Nº: 16, donde el nucleótido de la posición polimórfica de SEC ID 40 Nº: 16 como se muestra en la Tabla 2A es A.

10. Un kit que comprende un polinucleótido aislado de la reivindicación 5 o 7.

11. El kit de la reivindicación 10 que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 5 como un primer 45 polinucleótido.

12. El kit de la reivindicación 11, donde el kit comprende además un segundo polinucleótido aislado de entre 8-100 nucleótidos, donde dicho segundo polinucleótido distingue entre el primer alelo del SNP (o complemento del mismo) y el segundo alelo del SNP (o complemento del mismo) , y donde el primer polinucleótido es complementario del

nucleótido polimórfico en el primer alelo y el segundo polinucleótido es complementario del nucleótido polimórfico del segundo alelo.

13. El kit de la reivindicación 10, donde el kit comprende además uno o más cebadores para amplificar una región del locus de IGF2 que abarca el sitio polimórfico, donde el o los cebadores son diferentes del polinucleótido aislado. 55