Nuevo medio sin suero para inducir citoblastos pluripotentes rápidamente con alta eficiencia y método que usa el mismo.

Un medio sin suero para inducir citoblastos pluripotentes, que comprende un medio basal,

un aditivo de sustitución del suero formulado por sustitución de suero KnockOut (KOSR) y suplemento de N2, factor inhibidor de leucemia (LIF), y uno o más factores de crecimiento de tirosina cinasa de receptor seleccionados de al menos uno de bFGF, EGF, IGF2 o VEGF, en el que el bFGF tiene una concentración de 3 ng/ml a 20 ng/ml en el medio final.

Nuevo medio sin suero para inducir citoblastos pluripotentes rápidamente con alta eficiencia y método que usa el mismo Descripción

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un medio sin suero para inducir y reprogramar células somáticas en citoblastos pluripotentes inducidos (iPS) rápidamente con alta eficiencia, y el método que usa el mismo para inducir y reprogramar células somáticas sin nodriza, en el que la velocidad y eficiencia del proceso completo de inducir y reprogramar mejoran enormemente. Además, la presente invención también se refiere a los usos del medio en inducir citoblastos pluripotentes, y a los métodos para cribar compuestos, especialmente compuestos de cribado de alta resolución.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los citoblastos son la fuente inicial del cuerpo humano y los diversos histiocitos de los mismos, y biológicamente, se caracterizan prominentemente por su capacidad para auto-renovar y proliferar continuamente, además del potencial de diferenciación multi-direccional. Los citoblastos se dividen en citoblastos somáticos y citoblastos embrionarios (células ES) dependiendo de sus fuentes. Los citoblastos somáticos incluyen citoblastos mesenquimatosos de la médula ósea, citoblastos pancreáticos, citoblastos neurales, o similares, en tejidos adultos.

En 1981, células ES se aislaron y cultivaron satisfactoriamente por primera vez en ratones y las células ES de ratón son las más ampliamente estudiadas y con creces el sistema de citoblastos más maduro. Poco después, las células ES se han aislado y cultivado satisfactoriamente sucesivamente en animales grandes tales como ganado vacuno y ovejas.

Los estudios de células hES son prometedores, principalmente en trasplante terapéutico. En el campo de la ingeniería de tejidos, las células hES se usan como células semilla para proporcionar una gran cantidad de materiales para el trasplante clínico de células, tejidos u órganos. Pueden obtener tipos específicos de histiocitos mediante las estrategias in vitro de inducción y diferenciación que incluyen controlar la diferenciación y el cultivo de entornos de células hES y transfectar genes moleculares clave que pueden promover la diferenciación direccional de células ES. Tales células pueden usarse en trasplante, que traerá una nueva esperanza para el tratamiento de diabetes, enfermedades de Parkinson, lesión de la médula espinal, leucemia, daño miocárdico, insuficiencia renal, cirrosis hepática u otras enfermedades.

Los estudios de hES siempre se han enfrentado a muchos problemas y controversias que principalmente incluyen:

(1) Es difícil obtener la fuente de ovocitos de donante y la eficiencia de establecimiento de la línea de células hES es baja. Además, la tecnología de SCNT es inmadura, que inevitablemente producirá un mayor consumo de ovocitos humanos, por lo que es difícil de garantizar la fuente de ovocitos. (2) Puede producirse rechazo inmunológico. Los pacientes todavía rechazan inmunológicamente diversas células y tejidos diferenciados de células hES, a menos que se aplique la tecnología de SCNT. (3) Las células hES son tumorigénicas y pueden posiblemente desarrollar tumores después de trasplantarse en el cuerpo de un receptor. Este problema puede no resolverse bien a pesar del uso de la tecnología de SCNT, provisión de genes suicidas en células trasplantadas, u otras medidas (Reubinoff BE et al., Embr y onic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol 2000; 18: 399-404; Richards M et al., Bongso A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embr y onic stem cells. Nat Biotechnol 2002; 20:933-936; Burdon T et al., cell cycle and pluripotency in embr y onic stem cells. Trends Cell Biol 2002; 12: 432-438) . (4) Hay riesgos de mantener hES in vitro (Nakagawa M et al., N, Yamanaka S. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106) . Por tanto, la tecnología de transfección de lentivirus puede sufrir riesgos similares.

Para evitar controversias éticas sobre células hES y estudios de clonación terapéutica, es necesario encontrar una forma alternativa a transformar directamente células somáticas humanas en citoblastos pluripotentes inducidos y proporcionar pacientes con citoblastos autólogos "individualizados". En 2003, el grupo de estudio de Gurdon encontró que, después de inyectar los núcleos de timocitos de ratón completamente diferenciados o linfocitos de sangre periférica adultos en los ovocitos de Xenopus laevis, el marcador de diferenciación del núcleo de mamífero se perdió, mientras que Oct4, el marcador más característico en citoblastos de mamífero, se expresó altamente, que indica que los núcleos de células de mamífero pueden reconstruirse directamente y, por tanto, expresarse por las vacuolas nucleares de ovocitos de anfibio (Byrne JA et al., Nuclei of adult mammalian somatic cells are directly reprogrammed to oct-4 stem cell gene expression by amphibian oocytes. Curr Biol 2003; 13: 1206-1213) .

En 2006, el grupo de estudio de Yamanaka en la Universidad de Kioto (Japón) cribó cuatro factores de transcripción que incluían Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4 de 24 factores usando la tecnología de transfección génica in vitro, introdujo los cuatro factores de transcripción anteriores en fibroblastos embrionarios de ratón o fibroblastos de la piel de la punta de la cola de ratones adultos mediante retrovirus, y obtuvo una línea de citoblastos pluripotentes Fbx15+ bajo

las condiciones de cultivo para células ES de ratón. Esta línea celular es muy similar a las células ES de ratón en morfología celular, propiedades de crecimiento, marcadores de superficie, formación de teratomas o similares, mientras que es diferente de células ES de ratón en perfiles de expresión génica, patrones de metilación de ADN y generación de animales quiméricos, de manera que se llama citoblastos pluripotentes inducidos (células iPS) (Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embr y onic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663-676) .

En julio de 2007, el grupo de estudio de Yamanaka realizó adicionalmente cribado usando Nanog en lugar de Fbx15 y obtuvo una línea de células iPS Nanog+. Esta célula iPS no es solo muy similar a la célula ES de ratón en morfología celular, propiedades de crecimiento, marcadores de expresión y formación de teratoma que comprende las estructuras de histiocitos de las tres capas germinativa cuando se trasplantan subcutáneamente en el ratón, sino que también son casi idénticas a la célula ES de ratón en patrones de metilación de ADN, perfiles de expresión génica, estado de cromatina y generación de animales quiméricos. Además, el estudio también encontró que la reactivación del proto-oncogén c-Myc es responsable de la neoplasia producida en un animal quimérico; pero los cuatro genes transfectados anteriores no se expresan en la célula iPS. Esto indica que estos genes desempeñan una función solo en el proceso de inducción y el estado pluripotente de la célula iPS es atribuible a la expresión de factores de transcripción endógenos tales como el gen Nanog (Okita K, Ichisaka T et al., germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007; 448: 313-317) . Otro artículo publicado independientemente por algunos científicos americanos al mismo tiempo también confirmó que los cuatro factores de transcripción anteriores son suficientes para preparar fibroblastos de ratón inducidos y reconstruidos in vitro en células iPS que son similares a células ES de ratón (Wernig M et al., In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES cell-like state. Nature 2007; 448: 318-324) .

Se informó recientemente que las células de hígado de ratón y células epiteliales del estómago también pueden reconstruirse en células iPS, y como se reveló por análisis de seguimiento de líneas genéticas, las células iPS se derivan de la reconstrucción directa de células somáticas de linaje fijo y no se encuentra que la integración de retrovirus en loci de genes específicos esté relacionada con la reconstrucción de núcleos (Aoi T et al., Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science 2008) .

Algunos investigadores también obtuvieron sucesivamente células iPS introduciendo los cuatro mismos factores de transcripción en fibroblastos de piel humana usando la misma tecnología. Similarmente, pueden reconstruirse células sinoviales tipo fibroblasto humano primario, además de líneas celulares derivadas de fibroblastos neonatales, también en células iPS. Tales... [Seguir leyendo]

1. Un medio sin suero para inducir citoblastos pluripotentes, que comprende un medio basal, un aditivo de sustitución del suero formulado por sustitución de suero KnockOut (KOSR) y suplemento de N2, factor inhibidor de leucemia (LIF) , y uno o más factores de crecimiento de tirosina cinasa de receptor seleccionados de al menos uno de bFGF, EGF, IGF2 o VEGF, en el que el bFGF tiene una concentración de 3 ng/ml a 20 ng/ml en el medio final.

2. El medio de la reivindicación 1, en el que el medio basal incluye medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) , medio esencial mínimo (MEM) , medio basal de Eagle (BME) , F-10, F-12, RPMI 1640, medio esencial mínimo de Glasgow (GMEM) , medio esencial mínimo (MEM) , medio Dulbecco modificado por Iscove y M199, preferentemente DMEM.

3. El medio de la reivindicación 1, en el que en el medio final el KOSR tiene una concentración de aproximadamente el 10 % y el suplemento de N2 tiene una concentración de aproximadamente el 0, 5 %. 15

4. El medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los factores de crecimiento de tirosina cinasa de receptor pueden estar sustituidos con un estrógeno, preferentemente estradiol.

5. El medio de la reivindicación 1, en el que el bFGF tiene una concentración de 5 ng/ml a 15 ng/ml, lo más preferido 20 5 ng/ml a 7 ng/ml.

6. El medio de la reivindicación 1, en el que en el medio final el EGF tiene una concentración de aproximadamente 10 ng/ml.

7. El medio de la reivindicación 1, en el que en el medio final el IGF2 tiene una concentración de aproximadamente 25 ng/ml.

8. El medio de la reivindicación 1, en el que en el medio final el VEGF tiene una concentración de aproximadamente ng/ml. 30

9. El medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el medio incluye adicionalmente otros componentes adecuados para crecimiento celular, en el que los otros componentes están seleccionados de Lglutamina, NEAA MEM, piruvato de sodio y 2-mercaptoetanol.

10. Uso del medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un método para inducir citoblastos pluripotentes de células somáticas con alta eficacia, que comprende:

(a) introducir uno o más factores de citoblastos pluripotentes que se ha demostrado que son suficientes para inducir pluripotencia en células somáticas;

(b) cultivar las células somáticas resultantes de (a) en el medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en condiciones adecuadas para el crecimiento celular de manera que se induzcan las células somáticas en citoblastos pluripotentes;

(c) detectar y analizar las células inducidas para pluripotencia;

(d) recoger monoclones pluripotentes de los citoblastos pluripotentes inducidos;

(e) cultivar las células monoclónicas de (d) en un medio de citoblastos embrionarios en condiciones adecuadas para el crecimiento de citoblastos embrionarios.

11. Uso del medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un método para cribar compuestos, que comprende 50

(a) introducir uno o más factores de citoblastos pluripotentes en células somáticas;

(b) cultivar las células somáticas resultantes de (a) en el medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en condiciones adecuadas para el crecimiento celular de manera que se induzcan las células somáticas en citoblastos pluripotentes;

(c) detectar y analizar las células inducidas para pluripotencia;

(d) recoger monoclones pluripotentes de los citoblastos pluripotentes inducidos;

(e) cultivar las células monoclónicas de (d) en un medio de citoblastos embrionarios en condiciones adecuadas para el crecimiento de citoblastos embrionarios;

(f) cribar compuestos usando los citoblastos pluripotentes inducidos cultivados en (d) ; en el que los compuestos

se criban para su capacidad para afectar las condiciones de proceso e inducción iPS o su capacidad de sustitución de algunos o todos los factores actualmente conocidos requeridos por el proceso de inducción de iPS.