Nanopartículas que comprenden ligandos de ARN.

Nanopartículas para su uso en un método de terapia, en donde dichas nanopartículas comprenden un núcleo que incluye átomos metálicos y/o semiconductores,

y en donde el núcleo está ligado covalentemente a una pluralidad de ligandos que comprende al menos un ligando de ARN que comprende una molécula de ARNip o de miARN.

Nanopartículas que comprenden ligandos de ARN Campo de la invención

La presente invención se refiere a nanopartículas, y más particularmente a nanopartículas que comprenden ligandos de ARN tales como ARN interferente pequeño (ARNip) y micro-ARN (miARN), y a su uso en varias aplicaciones.

Antecedentes de la invención

Se ha encontrado que las moléculas de ARN pequeño desempeñan múltiples funciones en la regulación de la expresión génica. Estas incluyen degradación dirigida de ARNm por ARN interferentes pequeños (ARNip), silenciamiento génico post-transcripcional (PTG), represión de la traducción especifica de secuencia regulada por el desarrollo de ARNm por micro-ARN (miARN) y silenciamiento génico transcripcional dirigido. La actividad de ¡ARN limita la movilización de transposones y proporciona una defensa antiviral (Pal-Bhadra y col., 24). También se ha demostrado una función para la maquinaria de ¡ARN y ARN pequeños en la elección como diana de complejos de heterocromatina y el silenciamiento génico epigenético en sitios cromosómicos específicos (Verdel y col., 24). El silenciamiento post-transcripcional dependiente de ARN bicatenario (ARNbc), también conocido como ARN inhibidor pequeño (ARNip) o interferencia por ARN (¡ARN), es un fenómeno en el que los complejos de ARNbc pueden elegir como diana genes específicos de homología para el silenciamiento de un periodo de tiempo corto. Actúa de señal para promover la degradación de ARNm con identidad de secuencias. Un ARNip de 2 nt es generalmente suficientemente largo para inducir el silenciamiento específico de genes, pero suficientemente corto para evadir la respuesta del huésped (Elbashir y col., 21).

La disminución en la expresión de productos génicos elegidos como diana puede ser amplia, induciéndose el 9 % del silenciamiento por algunas moléculas de ARNip.

Como la administración de oligonucleótidos de molécula pequeña puede evitar las dificultades asociadas a la terapia génica, el uso de ARNip puede tener ventajas con respecto a la terapia génica tradicional. Hasta la fecha, la administración eficaz de genes terapéuticos basados en vector in vivo sigue siendo un obstáculo para la terapia génica satisfactoria. Se ha observado que, aunque la inactivación del gen diana por ARNip no es permanente, una única transfección de ARNip puede conducir a una inhibición prolongada de la proteína diana en las células parentales, así como de progenie (Tuschl, 21). Sin embargo, todavía hay un problema en la materia en la administración de ARNip.

El documento EP 1 249 52 A describe perlas de nanopartículas semiconductoras que tienen ADN covalentemente unido a la superficie de las perlas.

El documento WO 1/876 A1 describe nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a ellas y usos de éstas en ensayos para detectar ácidos nucleicos.

El documento WO 98/474 A describe nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a ellas y usos de éstas en ensayos para detectar ácidos nucleicos y separar el ácido nucleico seleccionado de otros ácidos nucleicos.

El documento EP 99 93 A1 describe nanocristales semiconductores fluorescentes asociados a un compuesto y

su uso en aplicaciones biológicas.

El documento WO 1/51665 A2 describe nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a ellas y usos de éstas en ensayos para detectar ácidos nucleicos y separar el ácido nucleico seleccionado de otros ácidos nucleicos.

Patolsky y col., 2, CHEMICAL COMMUNICATIONS- CHEMCOM, vol. 6, n2 12, páginas 125-126, describen la amplificación dendrítica del análisis de ADN por nanopartículas de Au funcionalizadas con oligonucleótidos.

Matzke y col., 23, SCIENCE, vol. 31, n2 5636, páginas 16-161, revisan el alcance extendido de la ¡ARN.

Miyagishi y col. 23, ANTISENSE AND NUCLEIC ACID DRUG DEVELOPMENT, vol. 13, n2. 1, páginas 1-7, describen una comparación de los efectos supresores de oligonucleótidos antisentido y ARNip dirigidos contra las mismas dianas en células de mamífero.

Choudhury y col., 24, INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, vol. 18, n2 1, páginas 71-77, describe cómo el ARN interferente pequeño (ARNip) inhibe la expresión del gen Her2/Neu, regula por incremento HLA de clase I e induce la apoptosis de líneas celulares tumorales positivas para Her2/Neu.

El documento WO 2/3244 (Consejo Superior de Investigaciones Científicas) desvela nanopartículas formadas a partir de átomos metálicos o semiconductores en los que ligandos que comprenden hidratos de carbono están ligados covalentemente al núcleo de las nanopartículas. Estas nanopartículas se usan para modular interacciones mediadas por hidratos de carbono y son solubles y no tóxicas. La solicitud PCT que reivindica prioridad del documento GB-A-313259.4 (Consejo Superior de Investigaciones Científicas y Midatech Limited) desvela nanopartículas magnéticas que tienen núcleos que comprenden átomos metálicos pasivos y magnéticos, estando el núcleo ligado covalentemente a ligandos.

Resumen de la invención

Ampliamente, la presente invención se refiere a nanopartículas comprenden que tienen un núcleo que incluye átomos metálicos y/o semiconductores, estando el núcleo ligado a ligandos de ARN. Los ligandos de ARN son secuencias de ARN cortas diseñadas para imitar a las secuencias de ARN interferente pequeño (ARNip) y de micro- ARN (miARN). Las nanopartículas pueden usarse para administrar los ligandos de ARN y tienen aplicaciones en una amplia variedad de aplicaciones, en sistemas in vitro y para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico. A modo de ejemplo, las nanopartículas de la presente invención pueden emplearse (1) para el silenciamiento génico transcripcional dirigido, (2) para la degradación de ARNm dirigido, (3) para ARNm de obtención de imágenes, (4) para inhibir rutas que emplean una pluralidad de ligandos de ARN sobre las mismas nanopartículas o diferentes, (5) para la administración de aerosoles, por ejemplo a los pulmones, (6) en combinación con silenciamiento de ARNm para elegir como diana ARNm resistente a ARNip y (7) para su uso como herramienta en genómica funcional.

En la materia, las secuencias de ARN cortas se llaman ARN interferentes pequeños (ARNip) o micro-ARN (miARN) dependiendo en su origen. Pueden usarse ambos tipos de secuencia para regular por disminución la expresión génica uniéndose a ARN complementarios (ARNm) y tanto provocando la eliminación de ARNm (¡ARN) como deteniendo la traducción de ARNm en proteína. Los ARNip se derivan por procesamiento de ARN bicatenarios largos y cuando se encuentran en la naturaleza normalmente son de origen exógeno. Los micro-ARN interferentes (miARN) son ARN no codificantes pequeños endógenamente codificados, derivados por el procesamiento de horquillas cortas. Tanto el ARNip como el miARN pueden inhibir la traducción de ARNm que llevan secuencias diana parcialmente complementarias sin escisión de ARN y degradar ARNm que llevan secuencias completamente complementarias. La 4 ruta de ¡ARN también actúa sobre el genoma como se trata en Science, 31: 16-161, 23).

El ARN asociado a las nanopartículas puede ser monocatenario o bicatenario (dúplex). Si se usan secuencias similares a miARN como ligandos, las secuencias de ARN pueden ser horquillas, es decir, incluyen regiones parcialmente complementarias hacia sus extremos que pueden hibridarse para formar la horquilla. Las nanopartículas pueden comprender opcionalmente adicionalmente tipos de ligandos, tales como hidratos de carbono para formar gluconanopartículas, y/o más de una especie de ARNip. Las nanopartículas y sus usos se tratan más abajo en más detalle. Ventajosamente, la unión del ARNip a la nanopartícula puede proporcionar protección para el ARNip de las exorribonucleasas presentes en la sangre, medios de cultivo de tejido o dentro de las células.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona nanopartículas para su uso en un método de terapia, en el que dichas nanopartículas comprenden un núcleo que incluye átomos metálicos y/o semiconductores, y en el que el núcleo está ligado covalentemente a una pluralidad de ligandos que comprenden al menos un ligando de ARN que comprende una molécula de ARNip o de miARN.

Las nanopartículas para su uso según el primer aspecto de la invención pueden ser para su uso en un método que es un método in vivo de regulación por disminución de un gen diana.

Las nanopartículas para su uso según el primer aspecto de la invención pueden ser para su uso en un método de tratamiento de cáncer, una infección viral o degeneración macular del ojo. En algunos casos, el cáncer es cáncer de mama o el virus es VIH, hepatitis o gripe.

1. Nanopartículas para su uso en un método de terapia, en donde dichas nanopartículas comprenden un núcleo que incluye átomos metálicos y/o semiconductores, y en donde el núcleo está ligado covalentemente a una pluralidad de ligandos que comprende al menos un ligando de ARN que comprende una molécula de ARNip o de miARN.

2. Nanopartículas para su uso según la reivindicación 1, en donde dicho método es un método in vivo de regular por disminución un gen diana.

3. Nanopartículas para su uso en un método de tratamiento de cáncer, una infección viral o degeneración macular del ojo, en donde dichas nanopartículas son como se han definido en la reivindicación 1.

4. Nanopartículas para su uso según la reivindicación 3, en donde el cáncer es cáncer de mama o el virus es VIH, hepatitis o gripe.

5. Nanopartículas para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las nanopartículas comprenden una señal de translocalización de la membrana de manera que pueden permear a través de la membrana celular.

6. Nanopartículas para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la nanopartícula está ligada covalentemente a dicho ligando de ARNip mediante un grupo conector.

7. Nanopartículas para su uso según la reivindicación 6, en donde el grupo conector es un grupo tiol, un grupo etileno o un grupo péptido.

8. Nanopartículas para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ligando es un ligando de ARNip y comprende un nucleótido protuberante en 3' de 2 ribonucleótidos.

9. Nanopartículas para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una primera hebra codificante o no codificante de una molécula de ARN está ligada covalentemente a un núcleo de nanopartícula mediante su extremo 5' y/o 3'.

1. Nanopartículas para su uso según la reivindicación 9, en donde una segunda hebra de la molécula de ARN que es complementaria a la primera hebra está hibridada con la primera hebra de la molécula de ARN.

11. Nanopartículas para su uso según la reivindicación 1, en donde la segunda hebra de ARN está ligada covalentemente a un núcleo de nanopartícula mediante su extremo 5' y/o 3'.

12. Nanopartículas para su uso según la reivindicación 1 o de la reivindicación 11, en donde la primera y la segunda hebras de la molécula de ARN se ligan por separado a núcleos de nanopartícula y posteriormente se hibridan juntas.

13. Nanopartículas para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ligando de ARN es un ligando de miARN y comprende una horquilla.

14. Nanopartículas para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ligando de ARN se basa en una secuencia del gen Her2.

15. Nanopartículas para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho ligando de ARN es monocatenario o bicatenario.

16. Nanopartículas para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho ligando de ARN tiene entre:

y 4 ribonucleótidos,

17 y 3 ribonucleótidos,

19 y 25 ribonucleótidos, o 21 y 23 ribonucleótidos.

17. Un método in vitro para regular por disminución un gen diana, comprendiendo el método poner en contacto células que contienen el gen con nanopartículas como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

18. El método de la reivindicación 17, en donde el método produce una inactivación transitoria del gen diana.

19. El método de la reivindicación 17 o de la reivindicación 18, en donde el método emplea nanopartículas que tienen al menos dos ligandos de ARN diferentes, tanto conjugados con las mismas nanopartículas como presentes en una composición de al menos dos tipos diferentes de nanopartículas, para regular por disminución la expresión en al menos dos genes en una ruta.

2. El método de la reivindicación 19, en el que la ruta es una ruta inflamatoria, una ruta antiviral, una ruta de señalización en cáncer, una ruta de metástasis o una ruta metabólica.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 2, en el que el ligando de ARN se basa en un dominio 1 conservado de una familia de genes parra regular por disminución la expresión de una pluralidad de miembros de la

familia de genes.