Mutaciones del gen de PIK3CA en cánceres humanos.

Método para identificar un individuo como candidato para terapia contra el cáncer con un inhibidor de p110α

, que comprende:

someter a prueba una primera muestra corporal obtenida del individuo, en el que la primera muestra corporal es un primer tejido que se sospecha que es neoplásico y una segunda muestra corporal obtenida del individuo en el que la segunda muestra corporal es un segundo tejido que no se sospecha que sea neoplásico para una mutación no sinónima, intragénica, activante en el exón 1, 9 ó 20 de una secuencia que codifica para PIK3CA, o la secuencia de proteína correspondiente, en el que una secuencia que codifica para PIK3CA de tipo natural comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2; e

identificar el individuo como candidato para terapia contra el cáncer con un inhibidor de p110α si se determina una mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA o en una secuencia que codifica para PIK3CA en la primera muestra corporal y si la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA 15 o en una secuencia que codifica para PIK3CA está ausente en la segunda muestra corporal.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12164819.

Solicitante: THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 3400 NORTH CHARLES STREET BALTIMORE, MD 21218 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: VOGELSTEIN, BERT, KINZLER, KENNETH, W., SAMUELS,YARDENA, VELCULESCU,VICTOR.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2537633_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Mutaciones del gen de PIK3CA en cánceres humanos

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La invención se refiere al campo de métodos terapéuticos para el cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las PI3K son lípido cinasas que funcionan como transductores de señales aguas abajo de receptores de la superficie celular y median rutas importantes para el crecimiento, la proliferación, la adhesión, la supervivencia y la motilidad celulares (1, 2) . Aunque se ha observado aumento de la actividad de PI3K en muchos tumores colorrectales y otros (3, 4) , no se ha identificado ninguna mutación intragénica de PI3K.

Se ha notificado anteriormente que miembros de la ruta de PIK3 están alterados en cánceres, por ejemplo, el gen supresor de tumores PTEN (15, 16) , cuya función es revertir la fosforilación mediada por PI3K (17, 18) . Se ha notificado la reduplicación o amplificación de las regiones cromosómicas que contienen PIK3CA y AKT2 en algunos cánceres humanos (2, 19, 20) , pero los genes que son las dianas de tales acontecimientos genéticos a gran escala no se han definido ni pueden definirse fácilmente. 20

El documento WO 98/31324, Zhang et al (Cancer Research, 63 (14) , 4225-4231) , Ma et al (Oncogene, 19 (23) , 2739-2744) y Shayesteh et al (Nature Genetics, 21 (1) , 99-102) dan a conocer la amplificación del gen de PIK3CA o la sobreexpresión del ARNm de PIK3CA en células cancerosas. Philip et al (Cancer Research, 61 (2) , 7426-7429) sugieren que tumores humanos pueden albergar mutaciones somáticas en genes de P13K. Sin embargo, no hay 25 ninguna descripción en estos documentos de una mutación no sinónima, intragénica, activante en el exón 1, 9 ó 20 de la secuencia que codifica para PIK3CA, o la secuencia de proteína correspondiente.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En una primera realización, se proporciona un método para identificar a un individuo como candidato para terapia contra el cáncer con un inhibidor de P110 según la reivindicación 1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Detección de mutaciones en PIK3CA. Ejemplos representativos de mutaciones en los exones 9 y 20. En cada caso, se obtuvo el cromatograma de secuencia superior de tejido normal y los tres cromatogramas de secuencia inferiores de los tumores indicados. Las flechas indican la ubicación de las mutaciones de cambio de sentido. Las alteraciones de nucleótidos y aminoácidos se indican por encima de la flecha.

Figura 2. Distribución de mutaciones en PIK3CA. Las flechas indican la ubicación de mutaciones de cambio de sentido, y los recuadros representan dominios funcionales (p85BD, dominio de unión a p85; RBD, dominio de unión a Ras; dominio C2; dominio helicoidal; dominio cinasa) . El porcentaje de mutaciones detectado dentro de cada región en cánceres se indica a continuación.

Figuras 3A-3C. Aumento de la actividad lípido cinasa de p110 mutante. Se transfectaron células NIH3T3 con vector vacío o con constructos de vector que contenía o bien p110 de tipo natural o bien p110 mutante (H1047R) tal como se indica por encima de los carriles. Se realizaron inmunoprecipitaciones con o bien IgG control o bien anticuerpos policlonales anti-p85. (Figura 3A) La mitad de los inmunoprecipitados se sometieron a un ensayo de PI3-cinasa usando fosfatidilinositol como sustrato. "PI3P" indica la posición de PI-3-fosfato determinada con marcadores 50 de fosfatidilo patrón y "Ori" indica el origen. (Figura 3B) La otra mitad de los inmunoprecipitados se analizó mediante inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpo anti-p110. (Figura 3C) Los lisados celulares de células transfectadas contenían cantidades similares de proteína total tal como se determina mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-tubulina . Se observaron resultados idénticos a los mostrados en esta figura en tres experimentos de transfección independientes. 55

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El agrupamiento de mutaciones dentro de PIK3CA lo convierten en un excelente marcador para la detección temprana o para el seguimiento de la progresión de la enfermedad. Las pruebas centradas en las regiones 60 agrupadas producirán la mayor parte de los alelos mutantes.

La secuencia que codifica para PIK3CA humana se notifica en la bibliografía y se muestra en SEQ ID NO: 1. Esta es la secuencia de un individuo particular en la población de seres humanos. Los seres humanos varían entre sí en sus secuencias génicas. Estas variaciones son muy mínimas, produciéndose algunas veces a una frecuencia de 65

aproximadamente 1 a 10 nucleótidos por gen. Existen formas diferentes de cualquier gen particular dentro de la población humana. Estas formas diferentes se denominan variantes alélicas. Las variantes alélicas a menudo no cambian la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada; tales variantes se denominan sinónimas. Incluso si cambian el aminoácido codificado (no sinónimas) , la función de la proteína no se ve afectada normalmente. Tales cambios son evolutiva o funcionalmente neutros. Cuando se hace referencia a PIK3CA humana en la presente 5 solicitud, se pretende que todas las variantes alélicas se abarquen por el término. La secuencia de SEQ ID NO: 1 se proporciona meramente como ejemplo representativo de una secuencia humana de tipo natural. La invención no se limita a esta forma alélica individual de PIK3CA. Para los fines de determinar una mutación, pueden compararse las secuencias de PIK3CA determinadas en una muestra de prueba con una secuencia determinada en un tejido diferente del ser humano. Una diferencia en la secuencia en los dos tejidos indica una mutación somática. 10 Alternativamente, puede compararse la secuencia determinada en un gen de PIK3CA en una muestra de prueba con la secuencia de SEQ ID NO: 1. Puede identificarse una diferencia entre la secuencia de muestra de prueba y SEQ ID NO: 1 como una mutación. Pueden someterse a prueba tejidos que se sospecha que son cancerosos, como también muestras corporales que puede esperarse que contengan células descamadas de tumores o células de cáncer. Las muestras corporales adecuadas para las pruebas incluyen sangre, suero, plasma, esputo, orina, heces, 15 aspirado del pezón, saliva y líquido cefalorraquídeo.

Las mutaciones en PIK3CA se agrupan en los exones 9 (SEQ ID NO: 4) y 20 (SEQ ID NO: 5) . Se producen otras mutaciones, pero estos dos exones parecen ser los puntos activos para las mutaciones. Muchas mutaciones se producen en el dominio helicoidal de PIK3CA (nt 1567-2124 de SEQ ID NO: 2) y en su dominio cinasa (nt 2095-3096 20 de SEQ ID NO: 2) . Menos se producen en el dominio P85BD de PIK3CA (nt 103-335 de SEQ ID NO: 2) . Se han encontrado mutaciones en los exones 1, 2, 4, 5, 7, 9, 13, 18 y 20. Puede someterse a prueba cualquier combinación de estos exones, opcionalmente junto con pruebas en otros exones. Las pruebas para detectar mutaciones pueden realizarse a lo largo de la secuencia codificante completa o pueden centrarse en las zonas en la que se ha encontrado que se agrupan las mutaciones. Se producen zonas activas particulares de mutaciones en las posiciones 25 de nucleótido 1624, 1633, 1636 y 3140 de la secuencia que codifica para PIK3CA.

Se han encontrado mutaciones de PIK3CA en una variedad de diferentes tipos de tumores. Por tanto, puede someterse a prueba cualquiera de una variedad de tumores para detectar mutaciones de PIK3CA. Estos tejidos incluyen, sin limitación: tejido colorrectal, tejido cerebral, tejido gástrico, tejido de mama y tejido pulmonar. 30

Puede detectarse cualquier tipo de mutación intragénica. Éstas incluyen mutaciones por sustitución, mutaciones por deleción y mutaciones por inserción. Es probable que el tamaño de las mutaciones sea pequeño, del orden de 1 a 3 nucleótidos. Las mutaciones que pueden detectarse incluyen, pero no se limitan a, G1624A, G1633A, C1636A, A3140G, G113A, T1258C, G3129T, C3139T y G2702T. Puede someterse a prueba cualquier combinación de estas 35 mutaciones.

Las mutaciones que se encuentran en PIK3CA parecen ser mutaciones activantes. Por tanto, pueden usarse regímenes terapéuticos que implican la inhibición de la actividad o expresión de p110 para inhibir la progresión de un tumor en un ser humano. Las moléculas inhibidoras que pueden usarse incluyen oligonucleótidos antisentido o 40 constructos antisentido, una molécula que comprende una región de unión a anticuerpo y moléculas de ARNip. Las moléculas que comprenden una región de unión a anticuerpo pueden ser anticuerpos completos, regiones variables de cadena sencilla, fragmentos de anticuerpo, conjugados de anticuerpo, etc. Las regiones de unión a anticuerpo pueden pero no necesitan unirse a los epítopos contenidos dentro del dominio... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para identificar un individuo como candidato para terapia contra el cáncer con un inhibidor de p110, que comprende:

someter a prueba una primera muestra corporal obtenida del individuo, en el que la primera muestra corporal es un primer tejido que se sospecha que es neoplásico y una segunda muestra corporal obtenida del individuo en el que la segunda muestra corporal es un segundo tejido que no se sospecha que sea neoplásico para una mutación no sinónima, intragénica, activante en el exón 1, 9 ó 20 de una secuencia que codifica para PIK3CA, o la secuencia de proteína correspondiente, en el que una secuencia que 10 codifica para PIK3CA de tipo natural comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2; e

identificar el individuo como candidato para terapia contra el cáncer con un inhibidor de p110 si se determina una mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA o en una secuencia que codifica para PIK3CA en la primera muestra corporal y si la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA 15 o en una secuencia que codifica para PIK3CA está ausente en la segunda muestra corporal.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba para detectar la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en el exón 1, 9 ó 20 de la secuencia que codifica para PIK3CA. 20

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el inhibidor de p110 se selecciona del grupo que consiste en LY294002, wortmanina y una molécula que comprende una región de unión a anticuerpo específica para p110.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba para detectar una mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en el exón 9 ó 20 de la secuencia que codifica para PIK3CA.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba 30 para detectar la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en su dominio helicoidal (nt 1567-2124 de SEQ ID NO: 2) .

6. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba para detectar la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en su dominio cinasa (nt 2095-35 3096 de SEQ ID NO: 2) .

7. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba para detectar la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en su dominio p85BD (n.

10. 335 of SEQ ID NO: 2) . 40

8. Método según la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda muestra corporal se someten a prueba para detectar la mutación no sinónima, intragénica, activante en PIK3CA en el nt 1624, 1633, 1636, 3140 de la secuencia que codifica para PIK3CA.

9. Método según la reivindicación 1, en el que la mutación no sinónima, intragénica, activante se selecciona del grupo que consiste en PIK3CA G1633A, C1636A, A3140G, G113A, T1258C, G1624A, G3129T, C3139T y G2702T.

10. Método según la reivindicación 1, en el que la mutación no sinónima, intragénica, activante es una mutación 50 de un solo nucleótido.


 

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