Microorganismos con mayor actividad de sacarosa mutasa.

Célula microbiana con una tasa de síntesis de isomaltulosa como mínimo 2 veces mayor que con el tipo natural,

la cual presenta en el genoma un gen smuA que codifica una sacarosa mutasa SmuA, de manera que al menos un elemento promotor de smuA es reemplazado por al menos 5 otro promotor (promotor sucedáneo) elegido entre:

a) un promotor endógeno del gen de la 3,4-dihidroxi-2-butanon-4-fosfato sintasa (ribB)

b) un promotor homólogo del promotor endógeno según a) procedente de una cepa donante ajena y

c) un fragmento funcional del promotor a) o b),

donde el promotor sucedáneo está caracterizado por un polinucleótido elegido del grupo formado por moléculas polinucleótidas con una secuencia de nucleótidos según SEQ ID Nº: 2 hasta SEQ ID Nº: 3 y secuencias homólogas de las mismas con al menos un 85% de coincidencia.

Microorganismos con mayor actividad de sacarosa mutasa

La presente invención se refiere a la preparación biotecnológica de ¡somaltulosa y a composiciones que contienen ¡somaltulosa, y proporciona mejores medios para ello, sobre todo células microbianas.

Los disacáridos ¡somaltulosa (palatinosa) y trehalulosa se pueden obtener por transposición (isomerización) de la sacarosa (azúcar de caña, azúcar de remolacha). Los productos de isomerización de la sacarosa, sobre todo la ¡somaltulosa, se emplean cada vez más como sucedáneo de la sacarosa en los productos alimenticios y afines. La ¡somaltulosa es un azúcar acariógeno de bajo índice glicémico que desde 2005 está autorizado como producto alimenticio o aditivo de uso alimentario. Además las composiciones de ¡somaltulosa o con contenido de ¡somaltulosa que pueden obtenerse a partir de la sacarosa son materias primas para preparar el alcohol de azúcar isomalt, una mezcla racémica de 1,6-GPS (6-O-a-D-glucopiranosil-D-sorbita) y 1,1-GPM (1-O-a-D- glucopiranosil-D-manita), así como sus derivados, en particular mezclas enriquecidas en GPS o GPM. Entretanto el isomalt se ha asentado como sucedáneo de azúcar en productos alimenticios y afines. La transformación de ¡somaltulosa a isomalt y productos similares tiene lugar, como es sabido, por hidrogenación catalítica y alternativamente por conversión biotecnológica.

La producción biotecnológica de ¡somaltulosa y trehalulosa tiene lugar como es sabido por isomerización enzimàtica de la sacarosa, utilizando preferiblemente células bacterianas inmovilizadas o fragmentos de ellas. En este caso la isomerización tiene lugar por acción del enzima bacteriano sacarosa mutasa, E. C. 5.4.99.11 (sinónimo: sacarosa ¡somerasa, sacarosa mutasa, ¡somaltulosa sintasa). Microorganismos que tienen actividad conocida de sacarosa mutasa y pueden utilizarse en procesos biotecnológicos son en concreto Profam/nobacferrubrum, Erw/n/a rbaponf/c/, Pseudomonas mesoac/'dopMa, Panfoea d/spersa y Serrada p/ymadr/ca. Su sacarosa mutasa es conocida por las denominaciones SmuA, Pali, SmtA, MutB, SIM y otras. Las sacarosa mutasas bacterianas son codificadas por un gen cromosomico. La expresión genética es controlada por un elemento promotor de sacarosa mutasa. De aquí en adelante estas sacarosa mutasas se mencionan unitariamente, de manera general, con la denominación "SmuA" de la sacarosa mutasa de P. rubrum, aunque las sacarosa mutasas no se limitarían a esta. En P. rabrum la SmuA es codificada por el gen cromosomico denominado smuA; la expresión es controlada por un elemento promotor de smuA. En lo sucesivo también figura la denominación smuA como representativa de los genes de sacarosa mutasa de otros organismos.

A través de las patentes EP 0751218 A y WO 95/20047 A se conocen microorganismos transgénicos modificados genéticamente que poseen actividad de sacarosa mutasa, en los cuales hay al menos un gen codificador de la actividad enzimàtica del metabolismo de la sacarosa que está inactivado por mutagénesis de la célula.

La tasa de conversión del substrato sacarosa a ¡somaltulosa y adicionalmente, dado el caso, a trehalulosa en los microorganismos conocidos es susceptible de mejora. Además en los microorganismos conocidos la actividad de sacarosa mutasa también depende de la concentración o presencia de sacarosa en el medio de cultivo, lo cual complica la realización del proceso biotecnológico. Asimismo existen limitaciones y disposiciones para organismos genéticamente alterados (GmO), como por ejemplo el Gentechnik-Sicherheitsverordnung (GenTSV) [Reg/amenfo a/emán de segundad en fecno/og/a genéf/caj. Además de microorganismos capaces de proporcionar un mayor rendimiento de ¡somaltulosa, también se desea de disponer de microorganismos mejorados que no estén sujetos a normas legales.

El problema técnico de la presente invención consiste en disponer de mejores métodos y medios, sobre todo de microorganismos mejorados, para la preparación biotecnológica de ¡somaltulosa y composiciones con contenido de ¡somaltulosa, que superen las conocidas desventajas del estado técnico.

La presente invención resuelve completamente el problema técnico proporcionando una nueva célula microbiana que comparada con el tipo natural de esta célula, preferiblemente sin modificar, muestra una tasa de formación - es decir de síntesis - de ¡somaltulosa multiplicada como mínimo por el factor 2, preferiblemente por el factor 2,5, con especial preferencia por el factor 3, 4, 5 o más.

A este respecto la presente invención proporciona preferiblemente una célula que posee una actividad - es decir en concreto una actividad volumétrica de la sacarosa mutasa expresada por la célula - multiplicada como mínimo por el factor 2, preferiblemente por el factor 2,5, con especial preferencia por el factor 3, 4, 5 o más en comparación con su tipo natural. En una forma de ejecución preferida la célula de la presente invención muestra una expresión de la sacarosa mutasa independiente del substrato, concretamente de la concentración de sacarosa, en comparación con su tipo natural.

En la presente invención, para disponer de la célula según la misma se prevé sustituir en la célula de tipo natural - preferiblemente sin modificar - la región no codificadora del promotor del gen smuA que codifica la sacarosa mutasa SmuA por otro promotor potente, preferiblemente endógeno u homólogo, o por un fragmento funcional del mismo (= promotor sucedáneo). Los presentes inventores encontraron sorprendentemente promotores muy efectivos de tipo homólogo y sobre todo endógeno, es decir propios del organismo, así como fragmentos de los mismos con los

cuales se puede incrementar la expresión del gen smuA y por tanto, especialmente, la concentración de sacarosa mutasa en el perlplasma de la célula, la actividad volumétrica y la tasa de formación de ¡somaltulosa en comparación con la célula de tipo natural.

Por consiguiente el objeto de la presente Invención es una célula que lleva en el genoma un gen de sacarosa mutasa, preferiblemente endógeno (gen smnA), que codifica una sacarosa mutasa (SmuA), en la cual un elemento promotor o un promotor de sacarosa mutasa (promotor de smuA) - es decir, al menos una unidad controladora o reguladora de la expresión de este gen - está reemplazado por otro promotor o un fragmento del mismo (promotor sucedáneo) escogido entre: (a) un promotor endógeno distinto del promotor de smuA procedente de la propia cepa de la célula (promotor propio, endógeno), en concreto el promotor del gen de la 3,4-dlhldroxl-2-butanon-4-fosfato slntasa (r/óB); (b) un promotor homólogo del promotor endógeno según (a) procedente de una cepa donante (promotor ajeno, homólogo), y (c) un fragmento funcional de promotor (a) o (b) - en que el promotor sucedáneo está caracterizado por una molécula pollnucleótlda escogida del grupo formado por moléculas con una secuencia de nucleótldos según SEQ ID N°: 2 hasta SEQ ID N°: 3 y secuencias homologas de las mismas con al menos 85% de coincidencia - que controla o regula especialmente la expresión de este gen smoA y sobre todo puede aumentarla respecto a la célula de tipo natural.

Según una forma de ejecución especialmente preferida esta célula es una cepa autoclonada, producida por autoclonaclón con sus propias secuencias genéticas (endógenas). Por lo tanto la célula de la presente invención es preferiblemente una cepa reorganizadora del promotor. Según la presente invención se crea una cepa con mejores propiedades utilizando una copla de otro fragmento regulador, no codificador de proteína, preferiblemente propio de la cepa (endógeno), es decir un promotor o fragmento funcional del mismo empleado para expresar su propia sacarosa mutasa mediante la reorganización del promotor. Ventajosamente esta cepa reorganizadora del promotor no forma ninguna proteína nueva, sino que preferentemente solo vehicula la expresión de mayores cantidades de la sacarosa mutasa SmuA propia de la célula, de la misma forma que su tipo natural. Por consiguiente no se prefiere ningún gen y/o fragmento genético ajeno a la célula y tampoco que la célula de la presente invención contenga moléculas ajenas de ácidos polinucleicos, codificadoras y/o no codificadoras, ni episomales ni cromosómicas. Se comprende que en esta variante de ejecución de la presente invención, para obtener la cepa de autoclonación se Introducen temporalmente en la célula elementos vectoriales intermediarios que no se manifiestan ahí de forma duradera, sino que preferentemente según la presente invención se eliminan de la célula por selección en el segundo paso de recomblnaclón. Las secuencias genéticas se intercambian preferiblemente sin dejar huella. En esta forma de... [Seguir leyendo]

1. Célula microbiana con una tasa de síntesis de ¡somaltulosa como mínimo 2 veces mayor que con el tipo natural, la cual presenta en el genoma un gen smuA que codifica una sacarosa mutasa SmuA, de manera que al menos un elemento promotor de smuA es reemplazado por al menos otro promotor (promotor sucedáneo) elegido entre:

a) un promotor endógeno del gen de la 3,4-dihidroxi-2-butanon-4-fosfato sintasa (r/óB)

b) un promotor homólogo del promotor endógeno según a) procedente de una cepa donante ajena y

c) un fragmento funcional del promotor a) o b),

donde el promotor sucedáneo está caracterizado por un polinucleótido elegido del grupo formado por moléculas polinucleótidas con una secuencia de nucleótidos según SEQ ID N°: 2 hasta SEQ ID N°: 3 y secuencias homologas de las mismas con al menos un 85% de coincidencia.

2. Célula según la reivindicación 1 con una actividad volumétrica de sacarosa mutasa SmuA incrementada al menos 2 veces respecto al tipo natural.

3. Célula según la reivindicación 1 o 2 con expresión de sacarosa mutasa SmuA independiente del substrato respecto al tipo natural.

4. Célula según una de las reivindicaciones 1 a 3, en la cual el promotor de smuA sustituido está localizado en la región intergenética entre smuA y un marco abierto de lectura (ORF) situado posteriormente.

5. Célula según una de las reivindicaciones precedentes que no contiene ni expresa información genética recombinante, genes heterólogos o fragmentos de genes.

6. Célula según una de las reivindicaciones precedentes, seleccionada del grupo formado por microorganismos de los géneros: Escherichia, Salmonella, Serratia, Erwinia, Enterobacter, Klebsiella, Rauoltella, Pectobacterium, Pseudomonas, Azotobacter, Pantoea, Leucaneay Protaminobacter.

7. Célula según la reivindicación 6, seleccionada de organismos de la especie Profam/noóacferruórum.

8. Molécula pollnucleótlda aislada que contiene un elemento regulador de la expresión de la sacarosa mutasa, el cual está seleccionado del grupo de promotores sucedáneos caracterizados en la reivindicación 1, y además comprende un segmento expresable codificador de la sacarosa mutasa que está bajo el control de expresión del elemento regulador.

9. Vector que contiene una o más moléculas polinucleótidas según la reivindicación 8.

10. Célula que contiene la molécula pollnucleótlda según la reivindicación 8 o el vector según la reivindicación 9.

11. Método para preparar una célula caracterizada en una de las reivindicaciones 1 a 3, que Incluye las etapas siguientes:

- preparación de una cepa de tipo natural de la célula y

- puesta en contacto de la cepa con la molécula pollnucleótlda según la reivindicación 8 y/o con el vector según la reivindicación 9.

12. Uso de la molécula pollnucleótlda según la reivindicación 8 para preparar una célula microbiana caracterizada en una de las reivindicaciones 1 a 3.

13. Método de preparación biotecnología de ¡somaltulosa o de una composición de ¡somaltulosa a partir de un substrato de sacarosa que Incluye la etapa siguiente: cultivo de la célula según una de las reivindicaciones 1 a 7 o 10 o de la célula producible según el procedimiento de la reivindicación 13 en un medio de cultivo que contiene el substrato, bajo unas condiciones que permiten la transformación del substrato en ¡somaltulosa o en una composición de ¡somaltulosa.

14. Uso de la célula según una de las reivindicaciones 1 a 7 o 10 para mejorar la producción biotecnología de ¡somaltulosa o de una composición de ¡somaltulosa a partir de un substrato de sacarosa.