Métodos de detección usando aptámeros.

Un método de detección de una molécula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo,

método que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptámero que comprende una modificación de pirimidina en la posición 5 y que tiene una afinidad específica por la molécula diana, formándose un complejo de afinidad de aptámero mediante la interacción de un aptámero con su molécula diana, si la molécula diana está presente en dicha muestra de ensayo, en donde un complejo de afinidad de aptámero es un complejo no covalente formado por la interacción de un aptámero con su molécula diana;

(b) tras la formación del complejo de afinidad de aptámero de la etapa (a), exponer dicha muestra de ensayo a una condición que desafíe cinéticamente los componentes de dicha muestra de ensayo, en donde el desafío cinético comprende:

(i) introducir una molécula competidora en la muestra de ensayo o

(ii) capturar el complejo de afinidad de aptámero sobre un soporte sólido, seguido del lavado con moléculas competidoras presentes en la solución de lavado, estando la molécula competidora seleccionada entre un oligonucleótido, un polianión, un polidextrano o varios dNTP; y

(iii) diluir la muestra de ensayo para enriquecerla en un complejo de afinidad de aptámero de un conjunto de complejos que incluye un complejo de afinidad de aptámero y complejos no específicos, reduciendo de este modo la dilución los complejos de aptámero-no diana en comparación con los complejos de aptámero-diana;

(c) detectar y/o cuantificar el aptámero del complejo de afinidad de aptámero o el complejo de afinidad de aptámero separado del resto de la muestra de ensayo.

Métodos de detección usando aptámeros Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a métodos, dispositivos, reactivos y kits para la detección de una molécula diana en una muestra y, más concretamente, a la detección y/o cuantificación de una o más moléculas diana que puedan estar contenidas en una muestra de ensayo.

Antecedentes

La siguiente descripción proporciona un resumen de la información relevante para la presente invención, y no se admite que parte de la información proporcionada o de las publicaciones a las que se hace referencia en el presente documento sea técnica anterior a la presente invención reivindicada.

Los ensayos dirigidos a la detección y cuantificación de moléculas fisiológicamente significativas en muestras biológicas y otras muestras son importantes herramientas en la investigación científica y en el campo de la atención sanitaria. Una clase de dichos ensayos incluye el uso de una micromatriz que incluye uno o más aptámeros inmovilizados sobre un soporte sólido. Todos los aptámeros son capaces de unirse a una molécula diana de una manera muy específica y con muy alta afinidad. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N2 5.475.096 titulada "Nucleic Acid Ligands"; véase también, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N2 6.242.246, la patente de Estados Unidos N2 6.458.543 y la patente de Estados Unidos N2 6.503.715, todas ellas tituladas "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". Una vez que la micromatriz se pone en contacto con una muestra, los aptámeros se unen a sus respectivas moléculas diana presentes en la muestra, permitiendo así determinar la ausencia, la presencia, la cantidad y/o la concentración de las moléculas diana en la muestra.

Una variación de este ensayo emplea aptámeros que incluyen grupos funcionales fotorreactivos que permiten a los aptámeros unirse covalentemente o "fotorreticular" sus moléculas diana. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N2 6.544.776 titulada "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". Estos aptámeros fotorreactivos también se conocen como fotoaptámeros. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N2 5.763.177, la patente de Estados Unidos N2 6.001.577 y la patente de Estados Unidos N2 6.291.184, todas ellas tituladas "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"; véase también, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N2 6.458.539, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands". Una vez puesta en contacto la micromatriz con la muestra y que los fotoaptámeros hayan tenido la oportunidad de unirse a sus moléculas diana, los fotoaptámeros se fotoactivan, y se lava el soporte sólido para eliminar cualquier molécula unida no específicamente. Se pueden usar condiciones duras de lavado, ya que las moléculas diana que se unen a los fotoaptámeros, en general, no se eliminan, debido a los enlaces covalentes efectuados por el/los grupo/s funcional/es fotoactivado/s en los fotoaptámeros. De esta manera, el ensayo permite determinar la ausencia, presencia, cantidad y/o concentración de las moléculas diana en la muestra de ensayo.

En ambos de estos formatos de ensayo, los aptámeros se inmovilizan sobre el soporte sólido antes de ponerlos en contacto con la muestra. En ciertas circunstancias, sin embargo, la inmovilización de los aptámeros antes del contacto con la muestra puede no proporcionar un ensayo óptimo. Por ejemplo, la inmovilización previa de los aptámeros puede producir la mezcla ineficaz de los aptámeros con las moléculas diana sobre la superficie del soporte sólido, conduciendo tal vez a largos tiempos de reacción y, por lo tanto, a períodos de incubación prolongados para permitir la unión eficaz de los aptámeros a sus moléculas diana. Además, cuando se emplean fotoaptámeros en el ensayo, y dependiendo del material utilizado como soporte sólido, el soporte sólido puede tender a dispersar o absorber la luz usada para efectuar la formación de los enlaces covalentes entre los fotoaptámeros y sus moléculas diana. Además, dependiendo del método empleado, la detección de moléculas diana unidas a sus aptámeros puede ser objeto de imprecisión, ya que la superficie del soporte sólido también se puede exponer a y ser afectada por cualquier agente de mareaje que se use. Finalmente, la inmovilización de los aptámeros en el soporte sólido, en general, implica una etapa de preparación del aptámero (es decir, la inmovilización) antes de la exposición de los aptámeros a la muestra, y esta etapa de preparación puede afectar a la actividad o funcionalidad de los aptámeros.

Por consiguiente, existe la necesidad de métodos, dispositivos, reactivos y kits que proporcionen ensayos de alta sensibilidad para la detección y/o la cuantificación de moléculas diana en una muestra de ensayo mediante la optimización de las condiciones que afectan (1) a la actividad de los aptámeros; (2) la eficacia de alcanzar equilibrios de unión para complejos de aptámero-molécula diana; (3) la formación de enlace/s covalente/s entre un aptámero y su molécula diana; y (4) la detección de los complejos de aptámero-molécula diana.

El documento US20030219801 se refiere al uso de una molécula de aptámero, diseñada para unirse selectivamente a un ligando, para capturar el ligando específico en una muestra, formando un complejo de aptámero-ligando, y la posterior separación del complejo del resto de la muestra y la amplificación de una subsecuencia del aptámero para identificar el ácido nucleico que ha capturado el ligando mediante el uso de una matriz de ácido nucleico y la

identificación del propio ligando.

Kirby et al., 2004 (Anal. Chem 76: 4066-4075) describen biosensores de aptámeros inmovilizados en perlas e introducidos en chips micromecanizados en la matriz de sensores de lengua electrónica, y usados para la detección y la cuantificación de proteínas. Kirby explica que los chips de aptámero podrían detectar proteínas en formatos de ensayo tanto de captura como de tipo sándwich.

El documento US2002/0037506 describe un ensayo de tipo sándwich basado en dos aptámeros que reconocen dos sitios independientes en una molécula diana. En particular, el documento US2002/0037506 proporciona un método de detección de la presencia de un compuesto diana en una sustancia que puede contener el compuesto diana que comprende la exposición de una sustancia que puede contener el compuesto diana a una molécula de captura capaz de unirse a dicha molécula diana, estando dicha molécula diana inmovilizada en un soporte sólido.

Baldrich et al., 2004 (Anal. Chem. 76: 7053-7063) describe una evaluación sistemática de los parámetros con efecto potencial sobre el rendimiento del ensayo de un aptámero ligado a una enzima (ELAA).

El documento US2005/0142582 describe un protocolo de selección in vitro mejorado que se basa en las separaciones magnéticas para la producción de aptámeros de ADN, que es relativamente fácil y escalable sin la necesidad de una robótica costosa. Los aptámeros seleccionados mediante los métodos se usaron en ensayos ligados a una enzima, transferencias Western y purificación por afinidad.

Sekiya et al ("In vitro selection of RNA aptamers against cellular and abnormal isoform of mouse prion protein". Nucleic Acids Symposium Seríes, Vol.49, N2 1, 1 de septiembre de 2005, páginas 361-362) describen un método de aislamiento de aptámeros de proteínas antipriónicas en el que el ARN del competidor está presente durante el período en el que el aptámero y la diana se pueden unir.

Sumario

La presente divulgación incluye métodos, dispositivos, reactivos y kits para la detección y/o la cuantificación de una o más moléculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo. En una realización, se pone en contacto una muestra de ensayo con un aptámero que incluye un marcador y que tiene una afinidad específica por una molécula diana. Se permite la formación de un complejo de afinidad de aptámero que incluye un aptámero unido a su molécula diana. Si la muestra de ensayo contiene la molécula diana, normalmente, se formará un complejo de afinidad de aptámero en la muestra de ensayo. Opcionalmente, el complejo de afinidad de aptámero se convierte en un complejo covalente de aptámero que incluye un aptámero unido covalentemente a su molécula diana. Entonces, es posible detectar y/o cuantificar el complejo de afinidad de aptámero (o complejo covalente de aptámero opcional) usando cualquiera de varios métodos conocidos por un experto en la materia, incluyendo, pero sin limitación, el uso de un soporte sólido, usando espectrometría de masas, y el uso de la reacción en cadena... [Seguir leyendo]

1. Un método de detección de una molécula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, método que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptámero que comprende una modificación de pirimidina en la posición 5 y que tiene una afinidad específica por la molécula diana, formándose un complejo de afinidad de aptámero mediante la interacción de un aptámero con su molécula diana, si la molécula diana está presente en dicha muestra de ensayo, en donde un complejo de afinidad de aptámero es un complejo no covalente formado por la interacción de un aptámero con su molécula diana;

(b) tras la formación del complejo de afinidad de aptámero de la etapa (a), exponer dicha muestra de ensayo a una condición que desafíe cinéticamente los componentes de dicha muestra de ensayo, en donde el desafío cinético comprende:

(i) introducir una molécula competidora en la muestra de ensayo o

(ii) capturar el complejo de afinidad de aptámero sobre un soporte sólido, seguido del lavado con moléculas competidoras presentes en la solución de lavado, estando la molécula competidora seleccionada entre un oligonucleótido, un polianión, un polidextrano o varios dNTP; y

(iii) diluir la muestra de ensayo para enriquecerla en un complejo de afinidad de aptámero de un conjunto de complejos que incluye un complejo de afinidad de aptámero y complejos no específicos, reduciendo de este modo la dilución los complejos de aptámero-no diana en comparación con los complejos de aptámero-diana;

(c) detectar y/o cuantificar el aptámero del complejo de afinidad de aptámero o el complejo de afinidad de aptámero separado del resto de la muestra de ensayo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha modificación de pirimidina en la posición 5 se selecciona del grupo que comprende 5-(A/-bencilcarboxiamida)-2-desoxiuridina, 5-(/V-isobutilcarboxiamida)-2-desoxiuridina, 5-{N- [2-(1 H-¡ndol-3-il)etil]carboxiamida)-2-desoxiuridina, cloruro de 5-(/V-[1 -(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2- desoxiuridina, 5-(/V-naftilcarboxiam¡da)-2-desoxiuridina y 5-(/V-[1 -(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2-desoxiuridina.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho aptámero es un ácido nucleico monocatenario, ácido nucleico bicatenario, ADN o ARN.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha molécula diana se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un hidrato de carbono, un polisacárido, una glucoproteína, una hormona, un receptor, un antígeno, un anticuerpo, un virus, un sustrato, un metabolito, un cofactor, un inhibidor, un fármaco, un colorante, un nutriente, un factor de crecimiento y un tejido.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra de ensayo es una muestra biológica seleccionada entre sangre entera, leucocitos, células mononucleares de sangre periférica, plasma, suero, esputo, aliento, orina, semen, saliva, líquido meníngeo, líquido amniótico, líquido glandular, líquido linfático, aspirado de líquido del pezón, aspirado bronquial, líquido sinovial, aspirado articular, células, un extracto celular, heces, tejido, una biopsiatisulary líquido cefalorraquídeo.