Método para seleccionar bacterias con acción antioxidante.

Un método para seleccionar bacterias de calidad alimentaria con propiedades antioxidantes,

que comprende:

a) una etapa de sincronización del desarrollo de gusanos Caenorhabditis elegans;

b) una etapa de alimentación de gusanos C. elegans con las bacterias de calidad alimentaria que se han de analizar;

c) una etapa de incubación de gusanos C. elegans en presencia de estrés oxidante;

d) una etapa de determinación de la viabilidad de dichos gusanos C. elegans que se incubaron en presencia de estrés oxidante; y

e) una etapa de selección de las bacterias de calidad alimentaria que permiten la mayor supervivencia de dichos gusanos C. elegans en presencia de estrés oxidante.

Método para seleccionar bacterias con acción antioxidante Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para seleccionar bacterias de calidad alimentaria con propiedades antioxidantes.

Técnica anterior Todos los sujetos vivos mantienen un ambiente reductor dentro de sus células. Sin embargo, debido al metabolismo aerobio por las mitocondrias y a otros factores, se producen especies reactivas derivadas de oxígeno, tales como peróxidos y radicales de oxígeno libres. El ambiente reductor es conservado por enzimas, tales como superóxidodismutasa, catalasa y glutatión-peroxidasa. Si se altera el estado redox normal, las especies reactivas de oxígeno pueden dañar todos los componentes de la célula, incluyendo proteínas, lípidos y especialmente el DNA. Este desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno y la capacidad para destoxificar los compuestos intermedios reactivos o reparar el daño causado por las especies reactivas de oxígeno se denomina estrés oxidante. En los seres humanos, el estrés oxidante es un factor importante en el envejecimiento y en las enfermedades degenerativas asociadas al envejecimiento, tales como cáncer, artritis, diabetes, arterioesclerosis, enfermedad de Lou Gehrig, enfermedad de Parkinson, insuficiencia cardíaca, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Huntington. La teoría del envejecimiento debido a los radicales libres establece que los organismos envejecen porque las células acumulan con el tiempo daños causados por especies reactivas de oxígeno.

Con el fin de evitar los efectos adversos del estrés oxidante, es necesaria la selección de componentes dietéticos que tengan propiedades antioxidantes. Especialmente bacterias de calidad alimentaria, en particular bacterias de ácido láctico, son componentes dietéticos antioxidantes adecuados, ya que su uso da como resultado ventajosamente un efecto a largo plazo de la acción antioxidante, por medio de la colonización del tracto intestinal.

La Patente de EE.UU. 6.884.415 describe un producto alimenticio antioxidante producido por la fermentación de un producto alimenticio que contiene Lactobacillus plantarum que tiene una actividad similar a la de la superóxidodismutasa (SOD) y una actividad de catalasa (CAT) , en presencia de un material natural que contiene manganeso. Sin embargo, se sabe que las bacterias de calidad alimentaria, incluyendo bacterias de ácido láctico, pueden tener propiedades antioxidantes no dependientes de la actividad de la catalasa ni de la SOD.

La solicitud de patente internacional WO 03/002131 describe una cepa de Lactobacillus fermentum como producto probiótico antioxidante. Las propiedades antioxidantes de esta cepa se caracterizaron in vitro por ensayos enzimáticos y medidas del potencial redox del glutatión.

La solicitud de patente internacional WO 00/20013 describe una cepa de Lactobacillus o Propionibacterium que da lugar a cantidades elevadas de ácido propiónico en el intestino de un mamífero para la fabricación de un medicamento para reducir los factores del estrés oxidante, tales como IL-6, especies reactivas de oxígeno y moléculas de adherencia. Uskova et al., 2009, Voprosy Pitania, vol. 78, 2009, páginas 18-23, describen que diferentes cepas de Lactobacillus y Streptococcus tienen propiedades antioxidantes in vitro.

Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un gusano transparente que vive en libertad (nematodo) en ambientes de suelos templados. C. elegans se alimenta de bacterias, en particular de la cepa OP50 de Escherichia coli. Por este motivo ha sido utilizado ampliamente como organismo modelo por una variedad de razones. Las cepas son baratas y fáciles de criar y pueden ser congeladas. Cuando se descongelan posteriormente, permanecen vivas, permitiendo su almacenamiento a largo plazo. Tienen un ciclo de vida corto y reproducible. C. elegans tiene la ventaja de ser un organismo eucariota multicelular que es lo suficientemente sencillo para ser estudiado con gran detalle. Este gusano tiene cerca del 40% de los genes ortólogos humanos entre todo el genoma, que lo convierte en un organismo relevante para la situación humana.

Caenorhabditis elegans se ha utilizado como sistema modelo animal para evaluar el daño oxidante y los efectos sobre el envejecimiento (Larsen, 1993, PNAS 90:8905-8909) . El estudio se ha llevado a cabo con una cepa mutante que tiene hiper-resistencia al estrés oxidante en comparación con su cepa precursora.

Además, Ikeda et al. (2007, AEM 73:6404-6409) han estudiado el efecto de las bacterias de ácido láctico sobre el ciclo de vida y resistencia a la Salmonella de C. elegans. Los autores sugieren que C. elegans puede ser un modelo adecuado para la selección de cepas de bacterias probióticas (que ejercen efectos beneficiosos sobre la salud humana cuando se ingieren en número suficiente) o sustancias antienvejecimiento dietéticas. Sin embargo, la resistencia frente al estrés oxidante no fue evaluada en este estudio. También se sabe que el largo ciclo de vida de C. elegans está relacionado con la vía de la insulina y relacionado con los genes ortólogos en los seres humanos implicados en el factor de crecimiento insulinoide y la diabetes (Glenn et al., 2004, J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 59:1251-1260) .

Sumario de la invención Los autores de la presente invención han encontrado que el sistema modelo animal Caenorhabditis elegans es un modelo adecuado para seleccionar la capacidad de bacterias de calidad alimentaria para contrarrestar los efectos dañinos del estrés oxidante. El ensayo de selección se puede realizar en medios líquidos en placas de microtitulación a la que se añaden bacterias, así como en placas de agar-agar con céspedes de bacterias como alimentación.

En particular, el efecto de estas bacterias de calidad alimentaria sobre la prevención de los daños que se producen por estrés oxidante, particularmente en forma de especies reactivas oxidantes, se puede analizar usando C. elegans. Se encontró que un modo adecuado de imponer el estrés oxidante a C. elegans era la adición de peróxido de hidrógeno. El método de selección de la presente invención es relativamente sencillo e incluso los resultados obtenidos son relevantes para la situación humana. Finalmente, el método permite ventajosamente seleccionar cepas de bacterias de calidad alimentaria con un efecto global anti-estrés oxidante, sin estar limitado a la selección de un mecanismo específico implicado en un efecto antioxidante, tal como la presencia de una enzima particular (por ejemplo, CAT, SOD) o la liberación de un factor particular, como es el caso de la técnica anterior.

Descripción detallada de la invención Método de selección utilizando Caenorhabditis elegans En una realización, la presente invención se refiere a un método para seleccionar bacterias de calidad alimentaria con propiedades antioxidantes, que comprende:

a. una etapa de sincronización del desarrollo de gusanos Caenorhabditis elegans (C. elegans) ;

b. una etapa de alimentación de dichos gusanos C. elegans con las bacterias de calidad alimentaria que se han de analizar;

c. una etapa de incubación de los gusanos C. elegans en presencia de estrés oxidante;

d. una etapa de determinación de la viabilidad de dichos gusanos C. elegans que se incubaron en presencia de estrés oxidante; y

e. una etapa de selección de las bacterias de calidad alimentaria que proporcionan la mayor supervivencia de dichos C. elegans en presencia de estrés oxidante.

En otra realización, la presente invención se refiere al uso de Caenorhabditis elegans en un método para seleccionar bacterias de calidad alimentaria con propiedades antioxidantes.

El desarrollo de C. elegans sincronizado por el método de acuerdo con la presente invención se realiza ventajosamente en gusanos que están en el mismo estadio de desarrollo. Los métodos para que se desarrollen y sincronicen gusanos C. elegans son conocidos en la técnica (En: W.B. Wood (ed) "The nematode Caenorhabditis elegans". Cold Spring Harbor Laborator y , Cold Spring Harbor, New York, pp 587-606; Chen et al., 2008, J. Cell Commun. Signal. 2:81-92) . Un modo adecuado de conseguir el desarrollo sincronizado es recoger huevos de adultos preñados y comenzar la eclosión de los huevos. Un modo adecuado para eclosionar los huevos es incubarlos durante una noche en medio M9 (MRS (medio de Man, Rogosa y Sharpe) al 10% en volumen, 100 µg/mL de fluorodesoxiuridina) más 5 µg/mL de colesterol. Posteriormente, se pueden aislar los gusanos en el estadio L1 y dejar que se desarrollen como se conoce en la técnica (En: W.B. Wood (ed) "The nematode Caenorhabditis elegans"; antes citado) . Preferiblemente, los gusanos se dejan que se desarrollen en los pocillos de una placa de microtitulación.... [Seguir leyendo]

1. Un método para seleccionar bacterias de calidad alimentaria con propiedades antioxidantes, que comprende: a) una etapa de sincronización del desarrollo de gusanos Caenorhabditis elegans; b) una etapa de alimentación de gusanos C. elegans con las bacterias de calidad alimentaria que se han de analizar; c) una etapa de incubación de gusanos C. elegans en presencia de estrés oxidante; d) una etapa de determinación de la viabilidad de dichos gusanos C. elegans que se incubaron en presencia de estrés oxidante; y e) una etapa de selección de las bacterias de calidad alimentaria que permiten la mayor supervivencia de dichos gusanos C. elegans en presencia de estrés oxidante.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que:

- la etapa c comprende además una etapa de incubación de gusanos C. elegans en ausencia de estrés oxidante como control, y por que -la etapa d comprende además una etapa de comparación de la viabilidad de dichos gusanos C. elegans que fueron incubados en presencia de estrés oxidante con la viabilidad de dichos gusanos C. elegans que fueron incubados en ausencia de estrés oxidante.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado por que dichos gusanos C. elegans son cepas mutantes BA17 fem-1 (hc17) de C. elegans.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 3, caracterizado por que dicho

C. elegans se desarrolla en los pocillos de una placa de microtitulación.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 3, caracterizado por que el C. elegans se desarrolla en placas de agar-agar.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 5, caracterizado por que un grupo de gusanos recibe una alimentación a base de Escherichia coli, más preferiblemente E. coli OP50, como control.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 6, caracterizado por que los gusanos se desarrollan y se incuban en presencia de un antibiótico.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 7, caracterizado por que dicho antibiótico es kanamicina, preferiblemente kanamicina a una concentración de 10 a 100 µg/mL.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 8, caracterizado por que dicho estrés oxidante se aplica añadiendo peróxido de hidrógeno (H2O2) , preferiblemente a una concentración final de 1 a 20 mM.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 9, caracterizado por que dicha etapa c. se realiza durante 5 minutos a 48 horas, preferiblemente durante 1 hora a 10 horas.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 10, caracterizado por que dichas bacterias de calidad alimentaria son cepas que pertenecen a las bacterias de ácido láctico.

12. El uso de Caenorhabditis elegans en un método para seleccionar bacterias de calidad alimentaria con propiedades antioxidantes.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por que dichas bacterias de calidad alimentaria son bacterias de ácido láctico.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, caracterizado por que el C. elegans es la cepa mutante BA17 fem-1 (hc17) de C. elegans.

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