Método para medir la actividad inhibidora sobre la unión ligando-receptor.

Un método para medir la presencia o ausencia y/o fuerza de la actividad inhibidora de una sustancia de ensayo sobre la unión entre un ligando y un receptor del mismo,

que comprende las etapas (1) a (4):

(1) inmovilizar la sustancia de ensayo o el ligando sobre un soporte sólido;

(2) poner en contacto la sustancia de ensayo y el ligando durante un periodo de tiempo dado en presencia o ausencia del receptor para el ligando;

(3) comparar el nivel de unión entre la sustancia de ensayo y el ligando en presencia y ausencia del receptor; y

(4) determinar que la sustancia de ensayo tiene actividad inhibidora sobre la unión ligando-receptor, si la unión entre la sustancia de ensayo y el ligando en presencia del receptor es más baja que en ausencia del receptor; o determinar la fuerza de la actividad inhibidora de la sustancia de ensayo sobre la unión entre el ligando y el receptor dependiendo de la dosis del receptor; donde la sustancia de ensayo es un anticuerpo y el ligando es una citocina.

Método para medir la actividad inhibidora sobre la unión ligando-receptor

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para medir la presencia o ausencia y/o fuerza de la actividad inhibidora de al menos una sustancia de ensayo sobre la unión entre un ligando y un receptor de la misma. El método de la presente invención es particularmente útil como un método altamente sensible y sencillo para la detección de la actividad neutralizante.

Técnica anterior

Cuando se administra repetidamente un fármaco en el organismo, dicha administración repetida puede dar lugar a un anticuerpo contra este fármaco. Incluso en el caso de fármacos recombinantes cuyas secuencias de aminoácidos son las mismas que las de las sustancias endógenas, existe una posibilidad de que surjan autoanticuerpos, algunos de los cuales pueden neutralizar las sustancias endógenas originales.

Por ejemplo, en el caso de la eritropoyetina recombinante humana (rhEPO) , se ha descubierto que algunos pacientes con insuficiencia renal que reciben EPO desarrollan un anticuerpo neutralizante contra la rhEPO aunque tales casossonmuyraros, ytambiénse ha notificado que esteanticuerpocausa una aplasia purade glóbulos rojos positiva para anticuerpos (APGRPA) como una complicación en algunos pacientes (Documento de No Patente 1) .

Dado que el desarrollo de un anticuerpo neutralizante contra un fármaco no solamente elimina la eficacia del fármaco, sino que también induce una nueva enfermedad, es importante detectar tal anticuerpo neutralizante en una etapa temprana. Sin embargo, los métodos convencionales usados para la detección de anticuerpos neutralizantes no son suficientes para este fin. A modo de ejemplo, para la medición de un anticuerpo anti-EPO, se han usado ensayos tales como los ELISA (Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a Enzima) , RIP (inmunoprecipitación radiactiva) y bioensayos para la medición del anticuerpo neutralizante, pero se ha señalado que estos métodos convencionales usados para la detección de anticuerpos neutralizantes no son suficientes en términos de sensibilidad de detección y/o de los procedimientos complicados (Documentos de No Patente 2, 3 y 4) . Además, los anticuerpos contra fármacos se producen en muy bajas concentraciones en el organismo, y, por lo tanto, ha sido muy difícil determinar si estos anticuerpos son anticuerpos neutralizantes.

Por estos motivos, una vez que se ha confirmado la producción de anticuerpos contra un fármaco, la administración del fármaco debe detenerse en algunos casos debido a motivos de seguridad, sin importar si este anticuerpo tiene una actividad neutralizante. Por lo tanto, existe una demanda de un método altamente sensible y sencillo para la detección de actividad neutralizante. Documento de No Patente 1: N Engl J Med. Febrero de 2002; 346 (7) :469-75. Documento de No Patente 2: Journal of Immunological Methods 283 (2003) 317-329 Documento de No Patente 3: Journal of Immunological Methods 300 (2005) 179-191 Documento de No Patente 4: Nephrol Dial Transplant (2005) 20[Supl.4]:iv16-22

Mason et al., Current Medical Research and opinion, 2003; 19 (7) ; 651-659 divulga la detección de anticuerpos contra agentes eritropoyéticos en suero humano.

Divulgación de la invención

Problemas a resolver por la invención

La presente invención se realizó en tales circunstancias y objetivos para proporcionar un método para medir la presencia o ausencia y/o la fuerza de la actividad inhibidora de una sustancia de ensayo sobre la unión entre un ligando y un receptor del mismo, cuyo método puede usarse para la detección altamente sensible y sencilla de anticuerpos neutralizantes.

Medios para resolver los problemas

Como resultado de los esfuerzos exhaustivos e intensivos que se han realizado para alcanzar el objetivo anterior, los inventores de la presente invención han descubierto que se pre-inmoviliza una sustancia de ensayo o un ligando sobre una superficie sólida y el nivel de unión entre la sustancia de ensayo y el ligando se compara en presencia o ausencia de un receptor para el ligando, por lo que la unión inhibida entre el ligando y el receptor puede detectarse con una alta sensibilidad. Este hallazgo condujo a la finalización de la presente invención.

Es decir, la presente invención se refiere a las realizaciones tal como se divulgan en las reivindicaciones. Más específicamente, la presente invención proporciona un método para medir la presencia o ausencia y/o fuerza de la actividad inhibidora de una sustancia de ensayo sobre la unión entre un ligando y un receptor del mismo, que comprende las etapas (1) a (4) :

(1) inmovilizarla sustancia de ensayo o el ligando sobre un soporte sólido;

(2) poner en contacto la sustancia de ensayo y el ligando para un periodo de tiempo dado en presencia o ausencia del receptor para el ligando;

(2) compararel nivel de unión entre la sustancia de ensayo y el ligando en presencia y ausencia del receptor; y

(4) determinar que la sustancia de ensayo tiene actividad inhibidora sobre la unión ligando-receptor, si la unión entre lasustancia de ensayo yel ligando enpresencia del receptoresmás baja queen ausenciadel receptor;o determinar la fuerza de la actividad inhibidora de la sustancia de ensayo sobre la unión entre el ligando y el receptor dependiendo de la dosis del receptor;

donde la sustancia de ensayo es un anticuerpo y el ligando es una citocina.

Ventajas de la invención

La presente invención se dirige a un nuevo método que permite la detección simple de la unión inhibida entre ligando y receptor incluso cuando una diana a ensayar está a una concentración baja. Además, dado que este método puede confirmar la unión inhibida entre ligando y receptor incluso cuando una diana a ensayar está a una concentración baja, es posible detectar, con alta sensibilidad, un anticuerpo neutralizante contra un fármaco producido en el organismo de un paciente que recibe la administración repetida del fármaco. Para confirmar si un anticuerpo de ensayo tiene actividad neutralizante usando un método convencional para detectar un anticuerpo neutralizante contra EPO (es decir, un método basado en un bioensayo para neutralizar la detección de un anticuerpo que se describe más adelante en el Ejemplo Comparativo 2) , se requiere que el anticuerpo esté en una cantidad de al menos 650 ng/ml, calculada como la concentración en suero. Por el contrario, en el método de detección de la presente invención, una concentración de anticuerpo de 40 ng/ml es suficiente para detectar un anticuerpo que tiene una actividad neutralizante. El método de la presente invención permite la detección temprana del desarrollo temprano de anticuerpos neutralizantes y también permite la administración apropiada de fármacos.

La presente invención se describirá adicionalmente en más detalle a modo de lossiguientes ejemplos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica que muestra el efecto de sEPOR (receptor de EPO soluble) a distintas concentraciones sobre la unión entre el anticuerpo anti-EPO y EPO. La Figura 2 es una gráfica que muestra el efecto de la concentración del anticuerpo anti-EPO sobre la unión a EPO, tal como se mide por un ensayo de receptor usando células AS-E2. La Figura 3 es una gráfica que muestra el efecto de la concentración del anticuerpo anti-EPO sobre la unión a EPO, tal como se mide por un bioensayo usando células AS-E2.

Modos de realización de la invención

Definición de términos y expresiones Generalmente, la expresión "sustancia de ensayo" se refiere a una sustancia que está contenida en plasma, suero, sangre, lágrimas, fluidocorporalosimilaresrecogidos apartirdeuna diana querecibe laadministracióndefármaco. De acuerdo con el método de la presente invención, la sustancia de ensayo es un anticuerpo.

Generalmente, el término "ligando" se refiere a una sustancia que se une a un receptor en el organismo y por lo tanto promueve o inhibe la transducción de señal en las células. El ligando de acuerdo con el método de la presente invención es una citocina tal como EPO, G-CSF e interferón.

Tal como se usa en el presente documento, el término "receptor" pretende referirse a una estructura que se une al "ligando" de la presente invención y de este modo causa respuestas celulares, o como alternativa, una estructura que es un fragmento de la estructura anterior y tiene al menos un sitio de unión para el "ligando". Cuando el "ligando" es una citocina tal como EPO, G-CSF o interferón, los ejemplos incluyen un receptor de esta citocina o un fragmento de este receptor (es decir, un fragmento de receptor que tiene al menos un sitio de unión para el... [Seguir leyendo]

1. Un método para medir la presencia o ausencia y/o fuerza de la actividad inhibidora de una sustancia de ensayo sobre la uniónentre un ligando y un receptor delmismo, que comprende las etapas (1) a (4) :

(1) inmovilizar la sustancia de ensayo o el ligando sobre un soporte sólido;

(2) poner en contacto la sustancia de ensayo y el ligando durante un periodo de tiempo dado en presencia o ausencia del receptor para el ligando;

(3) comparar el nivel de unión entre la sustancia de ensayo y el ligando en presencia y ausencia del receptor; y

(4) determinar que la sustancia de ensayo tiene actividad inhibidora sobre la unión ligando-receptor, si la unión entre la sustancia de ensayo yel ligando enpresencia del receptoresmás baja queen ausenciadel receptor;o determinar la fuerza de la actividad inhibidora de la sustancia de ensayo sobre la unión entre el ligando y el receptor dependiendo de la dosis del receptor; donde la sustancia de ensayo es un anticuerpo y el ligando es una citocina.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el nivel de unión entre la sustancia de ensayo y el ligando se mide por un método usado para detectar la unión física intermolecular.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el ligando es una citocina administrada a un paciente, y la sustancia de ensayo es un anticuerpo recogido del paciente.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el ligando es eritropoyetina, el receptor es un receptor de eritropoyetina y la sustancia de ensayo es un anticuerpo anti-eritropoyetina.

5. Un método para detectar la presencia o ausencia y/o fuerza de la actividad neutralizante de una sustancia de ensayo sobre un ligando en una muestra, que comprende el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.