Método para lisis celular en un tampón de reacción de RT-PCR.

Método para amplificación de un ácido nucleico diana de ARN, que comprende las etapas de

a) transferir una muestra de líquido con un primer volumen inferior a 2 μ

l que comprende una o más células eucariotas vivas en un recipiente,

b) añadir a dicho recipiente un tampón de reacción de RT-PCR en una etapa que comprende una ADN polimerasa termoestable capaz de realizar una RT-PCR en una etapa, y dNTP, con un segundo volumen, mientras que dicho segundo volumen es al menos 2x tan grande como dicho primer volumen,

b') incubar dicha muestra a una temperatura entre 37 ºC y 65 ºC de 30 segundos a 5 min.

c) calentar dicho recipiente durante al menos 20 segundos a al menos 90 ºC,

d) amplificar dicha diana en dicho recipiente por medio de una reacción en cadena de la polimerasa con una ADN polimerasa termoestable capaz de realizar una RT-PCR en una etapa sin realización de una etapa de purificación intermedia,

en el que la relación del número de dichas células vivas de la etapa a) frente al volumen de líquido en el que la reacción en cadena de la polimerasa de la etapa d) no es superior a 2 células/μl, dichas relación es de al menos 1 célula/25 μl.

Método para lisis celular en un tampón de reacción de RT-PCR Campo de la invención

La invención se refiere al campo del análisis de expresión de ARN por medio de PCR. Más específicamente, la presente invención proporciona un método para llevar a cabo análisis de expresión partiendo de un material de solamente unas pocas células, y análisis directo posterior de dicho ARN de muestra por medio de PCR en tiempo real.

Antecedentes de la invención

En las últimas décadas, la PCR se ha convertido en el "caballo de trabajo" para el análisis de ADN, ya que permite la amplificación exponencial de los ácidos nucleicos. En particular, la PCR en tiempo real (también denominada qPCR) se ha convertido en una herramienta poderosa ya que permite el análisis simultáneo del ácido nucleico amplificado durante la amplificación, o sin apertura intermedia, directamente después de la reacción de amplificación por medio de análisis de curva de fusión.

Por otra parte, la automatización de PCR así como de RT-PCR ha hecho progresos significativos, ya que ahora están disponibles sistemas de qPCR que permiten un rendimiento de 96, 384 o 1536 reacciones en paralelo en formiatos de placas de microtitulación. Los sistemas también se han vuelto más fáciles de usar. Por ejemplo, en el mercado están disponibles placas de microtitulación, en las que cada recipiente de reacción ya comprende los compuestos necesarios para realizar la amplificación por PCR o RT-PCR o amplificación y detección en una forma liofilizada, y el cliente solamente tiene que añadir la muestra que comprende el ácido nucleico a analizar, antes a la reacción real en sí. Advalytics proporciona un sistema alternativo (AG 48F) que permite la amplificación por PCR y la detección en portaobjetos de vidrio.

Sin embargo, todavía es un desafío mejorar aún más el flujo de trabajo para el análisis de PCR y RT-PCR, en particular, si el análisis se puede realizar solamente en el ARN que se origina solamente a partir de un pequeño número de células. En PCR en tiempo real tradicional, el ADN o el ARN se aísla primero a partir de células en un procedimiento que requiere mucho tiempo que puede conducir a una pérdida de material. Después de la cosecha, las células se lisan y el ADN se purifica al menos parcialmente a partir del lisado, porque de otro modo, la amplificación por PCR se podría inhibir al menos cuantitativamente.

Stahlberg A. et al. "Single-cell gene expression profiling using reverse transcription quantitative real-time PCR", abril de 21, METHODS 5 (4): 282-288) informa de un método para recoger células individuales mediante capilares de vidrio o citometría de flujo, seguido de evaluación por perfiles ARNm cuantitativa usando transcripción inversa y PCR en tiempo real.

En este contexto, el problema técnico que subyace en la presente invención era proporcionar un método de alto rendimiento mejorado y que se pudiera automatizar que permite un protocolo adicional de análisis de ácidos nucleicos simplificado.

Sumario

La presente invención proporciona un método a la amplificación de un ácido nucleico diana de ARN, que comprende las etapas de

a) transferir una muestra de líquido con un primer volumen inferior a 2 pl que comprende una o más células eucariotas vivas en un recipiente,

b) añadir a dicho recipiente un tampón de reacción de RT-PCR en una etapa que comprende una ADN polimerasa termoestable capaz de realizar una RT-PCR en una etapa, y dNTP, con un segundo volumen, mientras que dicho segundo volumen es al menos 2x tan grande como dicho primer volumen,

b) incubar dicha muestra a una temperatura entre 37 °C y 65 °C de 3 segundos a 5 min, c) calentar dicho recipiente durante al menos 2 segundos a al menos 9 °C,

d) amplificar dicha diana en dicho recipiente por medio de una reacción en cadena de la polimerasa con una ADN polimerasa termoestable capaz de realizar una RT-PCR en una etapa sin realización de una etapa de purificación intermedia,

en el que la relación del número de dichas células vivas de la etapa a) frente al volumen de líquido en el que la reacción en cadena de la polimerasa de la etapa d) no es superior a 2 células/pl, dicha relación es de al menos 1 célula/25 pl.

Dicho tampón de reacción de RT-PCR en una etapa de la etapa b) puede comprender además al menos una pareja de cebadores de amplificación y opcionalmente cualquiera de al menos una sonda de hibridación marcada o un compuesto fluorescente que se une a ADN bicatenario.

Como alternativa, dicho recipiente comprende una composición seca de al menos una pareja de cebadores de amplificación por PCR y opcionalmente al menos una sonda de hibridación marcada o un compuesto fluorescente que se une a ADN bicatenario.

En una realización, la actividad de dicha ADN Polimerasa termoestable se activa térmicamente durante la etapa c).

Además, en una realización que no es mutuamente excluyente con la realización que se ha desvelado anteriormente, dicha polimerasa es la Tth Polimerasa.

En una realización del método de la invención, dicho líquido que comprende al menos una o más células vivas se ha obtenido mediante un método de clasificación de células antes de la etapa a).

Preferentemente, el ácido nucleico que se amplificará es ARN. También está dentro del alcance de la presente invención, si el ARN diana solamente se expresa en cantidades muy bajas y/o se transcribe a partir de de ADN de una sola copia.

En otro aspecto, se proporciona un kit que comprende una pluralidad de recipientes de reacción diseñados para que se ajusten en un instrumento termociclador, y un tampón de reacción de PCR que comprende una ADN polimerasa termoestable capaz de realizar una RT-PCR en una etapa y dNTP.

En un aspecto, dicho kit comprende adicionalmente al menos una pareja de cebadores de amplificación, y opcionalmente cualquiera de al menos una sonda de hibridación marcada o un compuesto fluorescente que se une a ADN bicatenario.

En un aspecto alternativo, dichos recipientes de reacción dentro de dicho kit comprenden una composición seca de al menos una pareja de cebadores de amplificación por PCR y opcionalmente cualquiera de al menos una sonda de hibridación marcada o un compuesto fluorescente que se une a ADN bicatenario

Dicha pluralidad de recipientes de reacción se pueden conectar físicamente entre sí en una forma de una placa de microtitulación o una tira lineal de recipientes de reacción.

Además, dicha polimerasa termoestable dentro de dicho kit se puede activar preferentemente por vía térmica por medio de incubación durante al menos 1 minuto a 9 °C.

Descripción Detallada

En términos generales, la presente invención proporciona un método que permite la lisis de una muestra celular en un entorno líquido que posteriormente se usa directamente para análisis de expresión de ARN por medio de aplicación de una RT-PCR en una etapa sin ninguna etapa de purificación intermedia o procedimientos complejos de manipulación de líquidos. De forma más precisa, la presente invención proporciona un método para amplificación de un ácido nucleico diana de ARN, que comprende las etapas de

a) transferir una muestra de líquido con un primer volumen inferior a 2 pl que comprende una o más células eucariotas vivas en un recipiente,

b) añadir a dicho recipiente un tampón de reacción de RT-PCR en una etapa que comprende una ADN polimerasa termoestable capaz de realizar una RT-PCR en una etapa, y dNTP, con un segundo volumen, mientras que dicho segundo volumen es al menos 2x tan grande como dicho primer volumen,

b) incubar dicha muestra a una temperatura entre 37 °C y 65 °C de 3 segundos a 5 min, c) calentar dicho recipiente durante al menos 2 segundos a al menos 9 °C,

d) amplificar dicha diana en dicho recipiente por medio de una reacción en cadena de la polimerasa con una ADN polimerasa termoestable capaz de realizar una RT-PCR en una etapa sin realización de una etapa de purificación intermedia,

en el que la relación del número de dichas células vivas de la etapa a) frente al volumen de líquido en el que la reacción en cadena de la polimerasa de la etapa d) no es superior a 2 células/pl, dicha relación es de al menos 1 célula/25 pl.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención es posible que todas las etapas a), a), c) y d) se realicen dentro del mismo recipiente de reacción.

Tal como se demostrará con los ejemplos, la presente divulgación proporciona un método que se puede aplicar de forma sorprendente para realizar un análisis de RT-PCR en 1 etapa partiendo de solamente de una sola célula viva como material de muestra... [Seguir leyendo]

1. Método para amplificación de un ácido nucleico diana de ARN, que comprende las etapas de

a) transferir una muestra de líquido con un primer volumen inferior a 2 pl que comprende una o más células eucariotas vivas en un recipiente,

b) añadir a dicho recipiente un tampón de reacción de RT-PCR en una etapa que comprende una ADN polimerasa termoestable capaz de realizar una RT-PCR en una etapa, y dNTP, con un segundo volumen, mientras que dicho segundo volumen es al menos 2x tan grande como dicho primer volumen,

b) incubar dicha muestra a una temperatura entre 37 °C y 65 °C de 3 segundos a 5 min.

c) calentar dicho recipiente durante al menos 2 segundos a al menos 9 °C,

d) amplificar dicha diana en dicho recipiente por medio de una reacción en cadena de la polimerasa con una ADN polimerasa termoestable capaz de realizar una RT-PCR en una etapa sin realización de una etapa de purificación intermedia,

en el que la relación del número de dichas células vivas de la etapa a) frente al volumen de liquido en el que la reacción en cadena de la polimerasa de la etapa d) no es superior a 2 células/pl, dichas relación es de al menos

1 célula/25 pl.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que dicho tampón de reacción de RT-PCR de la etapa b) comprende además al menos una pareja de cebadores de amplificación y opcionalmente cualquiera de al menos una sonda de hibridación marcada o un compuesto fluorescente que se une a ADN bicatenario.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que dicho recipiente comprende una composición seca de al menos una pareja de cebadores de amplificación por PCR y opcionalmente cualquiera de al menos una sonda de hibridación marcada o un compuesto fluorescente que se une a ADN bicatenario.

4. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, caracterizado por que la actividad de dicha ADN polimerasa termoestable se activa térmicamente durante la etapa c).

5. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, en el que dicha polimerasa es la Tth Polimerasa.

6. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, caracterizado por que antes de la etapa a) dicho líquido que comprende al menos una o más células vivas se ha obtenido con un método de clasificación de células.