Método para la producción enzimática de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico a partir de acetona y acetil-CoA.

Un método para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico,

que comprende la conversión enzimática de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado caracterizado por la siguiente fórmula (I):**Fórmula**

en la que X es S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-5 NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-O-PO2H-C10H13N5O7P (coenzima A),

usando una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir, el C≥O) de acetona y el átomo de carbono (C2) correspondiente al grupo metilo de dicho compuesto que proporciona un grupo acetilo activado según la fórmula (I), y en el que dicha enzima es una enzima que tiene la actividad de una HMG CoA sintasa (EC 2.3.3.10).

Método para !a producción enzimàtica de ácido 3-hidroxi-3-meti!butirico a partir de acetona y acetì!-CoA

La presente invención se refiere a un método para ia producción de àcido 3-hidroxi-3-meti!butirico (también denominado como beta-hidroxiisovaierato o HiV) a partir de acetona y acetii-coenzima A que comprende !a conversión enzimàtica de acetona y acetii-coenzima A en àcido 3-hìdroxì-3-metiibutirico. La conversión hace uso de una enzima que es capaz de cataiizar ia formación de un eniace covaiente entre ei átomo de carbono dei grupo oxo (es decir, ei C=0) de acetona y ei grupo metiio de acetii-coenzima A. La enzima empieada en ei procedimiento es una enzima con ia actividad de una HMG CoA sintasa (EC 2.3.3.10). La presente invención también se refiere a organismos capaces de producir ácido 3-hìdroxi-3-metiibutirico a partir de acetona y acetii-coenzima A, y ai uso de ia enzima y organismos mencionados anteriormente para ia producción de àcido 3-hidroxì-3-metìibutirico. Fìnaimente, ia presente invención se refiere ai uso de acetona para ia producción de àcido 3-hìdroxì-3-metìibutirìco.

Ei àcido 3-hìdroxì-3-metiibutirico (también denominado corno beta-hidroxiisovaierato o HiV; véase ia Figura 1) es un metaboiito dei aminoácido esencia) ieucìna, y se sintetiza en ei cuerpo humano. Se puede encontrar en pequeñas cantidades en pomeio, aifaifa y bagre. También se sabe que aparece en atgunos trastornos metabóiicos dei catabotismo de !a ieucina, es decir, acidemia hipovaiénca. Se ha mostrado que e! ácido 3-hidroxi-3-met¡ibutír¡co puede tener un efecto en ei incremento de! peso muscuiary ia resistencia (Nissen et a!., J. Appi. Physioi. 81 (1996), 2095-2104). Witson et ai. (Nutrition & Metaboiism 5 (2008)) propone como ios mecanismos de acción io siguiente:

integridad sacroiémica incrementada vía conversión mediante HMG CoA reductasa

síntesis proteica potenciada vía !a ruta de mTOR

depresión de ia degradación proteica a través de !a inhibición de ia ruta de ubiquitina. Se supone que ei ácido 3-hidrox¡-3-metiibutínco ayuda a tos múscuios a combatir ia ruptura de ias proteínas, ayuda en ia reparación muscutar, y respaida ia resistencia incrementada. Se ha descrito que ayuda a pacientes con enfermedad putmonar obstructiva crónica en unidades de cuidados intensivos hospitaiarias, con desgaste muscutar asociado con HiV y cáncer, y víctimas de traumas con iesiones graves. De este modo, es de interés comercia) debido a su uso como potenciador muscuiar para cuiturismo, y como medicamento para evitar e! desgaste muscuiar. La patente de tos Estados Unidos 7026507 describe un procedimiento para preparar formulaciones sólidas de 3-hìdroxì-3-metìibutìrato de sodio en ei que, en una primera etapa dei procedimiento, se hace reaccionar 4,4-dimetiloxetan-2-ona con hidróxido sódico acuoso para formar una disoiución de 3- hidroxi-3-metilbutirato de sodio, y después, si es apropiado tras ia concentración, ia disoiución se apiica, en una etapa posterior del procedimiento, a sílice sintética, en !a que, si es apropiado, se seca ei producto resultante.

Sería deseable proporcionar un procedimiento para la producción de 3-hidroxi-3-met¡ibut¡rato que fuese independiente de las etapas de producción inorgánicas y que se pudiese efectuar en organismos vivos siendo de ese modo medioambientalmente bueno y barato. En este contexto, Lee et al. (Appi. Environ. Microbio). 63 (1997), 4191-4195) describen un método para la producción de 3-hidroxi-3-met¡lbut¡rato convirtiendo ácido 3-metiibutírico en ácido 3-hidrox¡-3-metilbutír¡co usando el microorganismo Galactomyces reessii. Además, Crouch et al. (Tetrahedron 53 (1997), 6993-7010) describen un método para la producción de 3-hidroxi-3-metilbutirato a partir de 2-oxo-4- metilpentanoato usando la enzima alfa-cetoisocaproato dioxigenasa. Sin embargo, aunque estos procedimientos permitieron la producción de 3-hidroxi-3-met¡lbut¡rato, todavía existe la necesidad de proporcionar vías eficientes alternativas y eficaces desde el punto de vista del coste para producir 3-hidrox¡-3-metilbut¡rato, en particular mediante procesos biológicos.

La presente invención satisface esta demanda de un procedimiento alternativo para la producción de 3-hidrox¡-3- metilbutirato, y proporciona un método que se basa en fuentes biológicas y permite producir 3-hidrox¡-3-metilbut¡rato in vitro o in vivo en un microorganismo u otra especie.

En particular, la presente invención se refiere a un método para la producción de ácido 3-hidrox¡-3-metilbutír¡co (también denominado como beta-hidroxiisovaierato o HIV) a partir de acetona y acetil-coenzima A, que comprende la conversión enzimàtica de acetona y acetil coenzima A en ácido 3-hidroxi-3-met¡lbutír¡co.

La acetona se representa mediante la siguiente fórmula: CH3-(C=0)-CH3. El compuesto que proporciona un grupo acetilo activado se caracteriza por la siguiente fórmula (I):

H

/

en la que X es S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-O-PO2H-C10H13N5O7P (coenzima A).

La conversión hace uso de una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir, el C=0) de acetona y el átomo de carbono (C^) correspondiente al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetllo activado según la fórmula (I). Según este esquema de reacción, el grupo oxo de la acetona reacciona como un electrófllo, y el grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetllo activado según la fórmula (I) reacciona como un nucleófllo. La reacción de la conversión de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetllo activado según la fórmula (I) se muestra en la Figura 5.

La reacción puede suceder en una etapa, es decir, 3-hldroxl-3-met¡lbut¡rato puede ser el producto directo de una reacción catalizada por la enzima descrita anteriormente. Como alternativa, la reacción puede comprender dos etapas, cuando se usa acetll CoA como el compuesto que proporciona un grupo acetllo activado, en el sentido de que primero se produce un aducto de 3-hldroxl-3-met¡lbut¡rato y el compuesto que proporciona un grupo acetllo activado, por ejemplo 3-hldroxl-3-metllbutlrll-CoA, que se hldrollza subsiguientemente, por ejemplo, a 3-hldrox¡-3- metllbutlrato y CoA. De este modo, en la primera alternativa, la enzima cataliza la reacción completa como se muestra en la Figura 5. En la segunda alternativa, la enzima cataliza la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir, el C=Oj de acetona y el átomo de carbono (C^) correspondiente al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetllo activado según la fórmula (I), pero X permanece en la molécula. X se elimina entonces subsiguientemente de la molécula mediante hidrólisis.

La presente Invención muestra por primera vez que es posible producir 3-hldroxl-3-met¡lbut¡rato haciendo uso de una enzima que puede transferir un grupo acetllo activado a acetona. En la técnica anterior, se ha dado a conocer la producción de 3-hldroxl-3-met¡lbut¡rato a partir de ácido ¡sovalérlco mediante la bloconverslón usando el hongo Galactomyces reessü. Sin embargo, considerando que el ácido ¡sovalérlco se obtiene de leuclna a través de descarboxllaclón y que la propia leuclna deriva del metabolismo a partir de la condensación global de dos moléculas de plruvato y una molécula de acetll CoA, este procedimiento de producción es energéticamente desfavorable. El procedimiento de la presente Invención evita esta desventaja. El compuesto que proporciona un grupo acetilo activado es acetll CoA. Acetll CoA (también conocida como acetll Coenzlma A) en estructura química es el tioéster entre la coenzlma A (un tlol) y ácido acético.

La enzima empleada en el procedimiento es una enzima con la actividad de una HMG CoA sintasa (EC 2.3.3.10).

El método según la presente Invención comprende la conversión enzimàtica de acetona y aceti! CoA en 3-hidroxi-3- metllbutlrato con una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir, el C=0) de acetona y el átomo de carbono C^ de aceti! CoA según la fórmula (I). La enzima empleada en el procedimiento según la Invención es una enzima que tiene la actividad de una HMG CoA slntasa (EC 2.3.3.10).

En particular, se ha mostrado en el contexto de la presente Invención que HMG CoA sintasa puede aceptar acetona en lugar de su sustrato normal, acetoacetlI-CoA, permitiendo de ese modo la conversión de acetil-CoA (o un compuesto según la fórmula (I)) y acetona en 3-hldroxl-3-met¡lbut¡rato.

En el contexto de la presente solicitud, la expresión... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutirico, que comprende la conversión enzimàtica de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado caracterizado por la siguiente fòrmula (I):

H

/

HC2H

1=0

X

en la que X es S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-O-PO2H-C10H13N5O7P (coenzima A),

usando una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono de! grupo oxo (es decir, el C=0) de acetona y el átomo de carbono (C^) correspondiente al grupo metilo de dicho compuesto que proporciona un grupo acetilo activado según la fórmula (I), y en el que dicha enzima es una enzima que tiene la actividad de una HMG CoA sintasa (EC 2.3.3.10).

2. El método de la reivindicación 1, que se caracteriza por que la conversión se realiza en presencia de un organismo capaz de producir acetona y que expresa la enzima como se define en la reivindicación 1.

3. Un organismo recombinante que se caracteriza por las siguientes características:

(a) es capaz de producir acetona; y

(b) expresa una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir, el 0=0) de acetona y el átomo de carbono (C^) correspondiente al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado según la fórmula (I), en la que X es coenzima A, y en el que dicha enzima es una enzima que tiene la actividad de una HMG CoA sintasa (EC 2.3.3.10).

4. El organismo de la reivindicación 3, en el que el organismo es un organismo que tiene naturalmente la capacidad para producir acetona.

5. El organismo de la reivindicación 4, en el que el organismo es un microorganismo que pertenece al género Clostridium, Bacillus o Pseudomonas.

6. El microorganismo de la reivindicación 5, en el que el microorganismo es un microorganismo que pertenece a las especies Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum, Bacillus polymyxa o Pseudomonas putida.

7. El organismo de la reivindicación 3, en el que el organismo deriva de un organismo que no produce naturalmente acetona y está modificado genéticamente para que sea capaz de producir acetona mediante la introducción de un gen o genes necesarios para permitir la producción de acetona en el organismo.

8. El organismo de la reivindicación 7, en el que el organismo es un organismo capaz de fotosíntesis.

9. Uso de un organismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, para la producción de ácido 3-hidroxi-3-met¡lbutírico.

10. Una composición que comprende un organismo de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

11. Una composición que comprende

(i) acetona; y

(¡i) un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado caracterizado por la siguiente fórmula (I):

H

H

C^-H

^pE=0

X

en la que X es S-CH2-CH2-NH-C0-CH2-CH2-NH-C0-CH(0H)-C(CH3)2-CH2-0-P02H-0-P02H- C10H13N5O7P (coenzima A); y

(iii) una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del 5 grupo oxo (es decir, el C=0) de acetona y el átomo de carbono (C^) correspondiente al grupo metilo del

compuesto definido en (¡i), en el que dicha enzima es una enzima que tiene la actividad enzimàtica de una HMG CoA sintasa (EC 2.3.3.10)

12. Uso de una enzima como se define en la reivindicación 1, para la producción de ácido 3-hidroxi-3-met¡lbutír¡co.

13. Uso de acetona para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico, que comprende la conversión enzimàtica 10 de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado caracterizado por la siguiente fórmula (I):

H

/

H

en la que X es S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-O-PO2H-C10H13N5O7P (coenzima A), y en el que la conversión enzimàtica se efectúa mediante una enzima que tiene la actividad enzimàtica de una HMG CoA sintasa (EC 2.3.3.10).