Método para la detección urinaria de cáncer de vejiga.

Un método para la detección in vitro de cáncer de vejiga en un paciente,

caracterizado porque comprende las etapas de:

(i) extraer el ADN contenido en una muestra de orina tomada de dicho paciente;

(ii) fragmentar el ADN extraído en la etapa (i);

(iii) marcar los fragmentos de ADN obtenidos uniformemente con un agente marcador de manera que se forma un conjunto de ADN marcado;

(iv) formar al menos una alícuota del conjunto de ADN marcado y poner en contacto cada alícuota con un conjunto de ADN de referencia, llevándose a cabo dicho contacto en condiciones que permiten la hibridación específica de los fragmentos de ADN marcados con dichos ADN de referencia; comprendiendo dichos ADN de referencia las secuencias de ADN incluidas en cada uno de los loci siguientes presentes en los cromosomas humanos: 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p, 19 y 22;

(v) eliminar los fragmentos de ADN marcados que no hibridan específicamente con los ADN de referencia;

(vi) determinar la intensidad de la señal producida por los fragmentos marcados hibridados con cada uno de los ADN de referencia seleccionados;

(vii) determinar, para cada ADN de referencia, las desviaciones entre las señales obtenidas en comparación con las obtenidas con un ADN control de un paciente sano;

(viii) derivar el estadio del cáncer del paciente de dichas desviaciones observadas para los loci 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22- qter, 17p, 19 y 22.

Método para la detección urinaria de cáncer de vejiga

La invención se refiere al diagnóstico de cáncer de vejiga y más particularmente a la detección urinaria del tipo transicional de carcinoma de vejiga (TCC: carcinoma de células transicionales).

Los carcinomas del tipo transicional se encuentran en tumores de epitelio transicional, que comprenden aproximadamente el 70% a 90% de los tumores de vejiga epitelial. Se caracterizan por su gran variabilidad morfológica, de manera que su pronóstico es a veces difícil de predecir.

En términos de histología, los tumores uroteliales pueden ser papilares o no papilares, de malignidad alta o baja (grado histológico), infiltrantes o no infiltrantes, siendo cada lesión los resultados combinados de estas tres características morfológicas.

Existen varias clasificaciones para los tumores uroteliales de la vejiga. La clasificación usada más comúnmente hasta el momento ha sido la de la OMS, que existe desde 1974. Clasificaba los cánceres transicionales del epitelio como benigno (papiloma exofítlco, papiloma Invertido) o maligno (carcinomas epiteliales transicionales de grados 1, 2 y 3). En 1998, después de varias reuniones que implicaban a patólogos anatómicos, urólogos, oncólogos y biólogos, se estableció y validó una clasificación consensuada de tumores uroteliales. Es esta nueva clasificación (Epstein J.I., Am. J. Surg. Pathol. (1998), 22: 1435-1448) la que se usa actualmente. Aunque sólo es ligeramente diferente a la clasificación previa de la OMS, tiene la ventaja de una mayor concordancia con la biología y el potencial evolutivo de los tumores uroteliales.

Según esta clasificación, los tumores de vejiga se clasifican por "grado", de G1 a G3, según diferentes criterios citomorfológicos. Cuanto mayor es el grado, menos diferenciada es la apariencia de las células y más agresivos son.

Los tumores también se clasifican según sus características superficiales (pTa y T1) o capacidad de invasión en el músculo (de T2 a T4). Los tumores de grado bajo son generalmente no Invasivos o se han infiltrado en las capas superficiales (estadios Ta y T1), mientras los tumores de grado alto son más agresivos y frecuentemente se detectan en T1 o un estadio más avanzado.

La determinación del grado de las células tumorales tiene una importancia crítica para el médico, ya que ayudará a decidir qué métodos terapéuticos deben usarse.

Mientras la presencia de tumores invasivos de grado 3 requiere la ablación total de la vejiga y sus glándulas auxiliares, la mayor parte de los tumores de grado/estadio bajo (Ta y T1) pueden tratarse generalmente localmente permaneciendo el órgano intacto, mediante diferentes estrategias terapéuticas tales como quimioterapia, inmunoterapia o terapia BCG.

Los pacientes que padecen un tumor de grado bajo, no invasivo, tienen generalmente un buen pronóstico, pero tienen que someterse a un seguimiento periódico ya que el riesgo de recaída del cáncer es del orden de 70%. Consecuentemente, los pacientes deben monitorizare de una manera regular después del tratamiento, cada tres meses durante los primeros dos años, y cada seis meses posteriormente, y en el caso de una recaída es muy importante monitorizar la progresión de los tumores.

Además, los tumores de grado bajo Ta invaden el músculo sólo en el 10-15% de los casos, mientras los tumores T1 progresan a grado T2 en el 30-35% de los casos. Los tumores de grado alto progresan más rápidamente, alcanzando los pacientes rápidamente el grado T2, y formándose metástasis remotas frecuentemente durante el curso de los dos años siguientes.

Actualmente, sólo los exámenes clínicos invasivos, en otras palabras que implican biopsia, visualización endoscópica directa de los tumores, o cirugía, pueden permitir establecer un diagnóstico fiable del grado de las células tumorales, y la implementación de una terapia apropiada.

Aún así, algunas veces la endoscopia no es fiable y es difícil de interpretar. Respecto a la citología después de una biopsia, varios estudios muestran que su fiabilidad es mediocre, lo que resulta en la detección fallida del 50% de los tumores (Boman, H., et al., 2002, J. Urol., 167(1): 80-83).

Debido a la alta prevalencia del cáncer de vejiga en la población, en particular en personas mayores de 50, y con el objetivo de mejorar tanto el diagnóstico como el confort de los pacientes, se han dedicado esfuerzos en investigación considerables para el desarrollo de una detección indirecta no invasiva del cáncer de vejiga.

A este respecto, varios equipos de investigación han intentado detectar tumores urológicos mediante muestras urinarias usando proteínas marcadoras de tumor convencionales.

Sin embargo, hasta ahora, se ha encontrado que la detección de estas proteínas no es suficientemente específica para ser fiable respecto al origen de las proteínas y el estadio del desarrollo de los tumores.

En 1999, un equipo americano describió la posibilidad de seguir la progresión del cáncer de vejiga analizando secuencias de ADN microsatélite contenidas en la orina (Steiner et al. (1997) Nature Medicine 3: 621-624). Este método de detección, que consiste en amplificar y medir la variabilidad de algunas secuencias repetidas de ADN mitocondrial no codificadoras, se basa en la observación de que estas secuencias están alteradas generalmente en las células de carcinoma.

Sin embargo, esta técnica no es completamente satisfactoria, en tanto que no permite efectivamente determinar el grado de los tumores.

Otros métodos moleculares se basan en métodos de PCR, que intentan amplificar o detectar marcadores genéticos, tales como mutaciones locales en genes supresores de tumores, aplicados a los ADN presentes en la orina de los pacientes. Sin embargo, estos métodos requieren Iniciadores específicos que comprenden 20 a 40 nucleótidos, que no son fáciles de desarrollar, a la vista del tamaño y variabilidad del genoma humano. Además, tan pronto como el ADN de las células tumorales se mezcla en la orina con los ADN de las células sanas, la amplificación deseada se enmascara con la causada por los últimos.

La hibridación genómica comparativa basada en micromatriz (CGH en micromatriz) es un método que se ha usado para identificar marcadores genéticos asociados con determinadas patologías. Snljders et al [Snijders et al (2001) "Assembly of mlcroarrays for genome-wide measurement of DNA copy number" Nature Genetics, (29)] describen la matriz HumArray 1.14 que contiene 2.460 clones BAC y Pl que abarcan el genoma humano.

Las estrategias de hibridación genómica comparativa basada en micromatriz se usaron en primer lugar para Identificar algunos marcadores potenciales del cáncer de vejiga en 2003 [Veltman et al. (2003) "Array-based Comparatlve Genomic Hybridization for Genome-Wlde Screenlng of DNA Copy Number ¡n Bladder Tumors" Cáncer Research, 63, 2872-2880], Sin embargo, en este estudio no se observó una asociación estadísticamente significativa entre el patrón de alteraciones en el número de coplas y el estadio o grado del tumor.

Como resultado de la dificultad de emplear los diferentes marcadores genéticos conocidos del tipo transicional de carcinoma de vejiga, los inventores prefieren el uso de una estrategia innovadora basada en la detección simultánea de varias anomalías genéticas encontradas frecuentemente en las células TCC.

Para este propósito, listaron las anomalías genéticas principales encontradas en carcinomas de vejiga transicionales y seleccionaron las más representativas del grado de las células tumorales. En esta estrategia, dieron preferencia a las anomalías genéticas que consisten en alteraciones físicas en los cromosomas, tales como ploidías o deleciones, que resultan típicamente del análisis del cariotipo de las células tumorales. Después, desarrollaron una procedimiento innovador que permite la detección simultánea de la presencia o ausencia de anomalías genéticas seleccionadas en el ADN contenido en la orina de los pacientes.

Más particularmente, los inventores han seleccionado una matriz específica de 25 loci de cromosomas humanos (usando las técnicas de análisis comparativo de hibridación de cromosomas basado en matriz respecto al ADN total extraído de una muestra de orina) proporcionando una señal fluorescente significativa.

Hasta ahora, los ensayos basados en muestras de orina que ofrecen los mismos niveles de especificidad y sensibilidad, y que también son capaces de distinguir claramente entre tumores de grado bajo y alto no han estado disponibles (Budman L.l. et al., 2008 CUAJ 2(3): 212-221).

Este método tiene una capacidad increíble para diagnosticar la presencia de... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección ín vitro de cáncer de vejiga en un paciente, caracterizado porque comprende las etapas de:

(i) extraer el ADN contenido en una muestra de orina tomada de dicho paciente;

(ii) fragmentar el ADN extraído en la etapa (i);

(iii) marcar los fragmentos de ADN obtenidos uniformemente con un agente marcador de manera que se forma un conjunto de ADN marcado;

(iv) formar al menos una alícuota del conjunto de ADN marcado y poner en contacto cada alícuota con un conjunto de ADN de referencia, llevándose a cabo dicho contacto en condiciones que permiten la hibridación específica de los fragmentos de ADN marcados con dichos ADN de referencia; comprendiendo dichos ADN de referencia las secuencias de ADN incluidas en cada uno de los loci siguientes presentes en los cromosomas humanos: 1 p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11 p, 14q22-qter, 17p, 19 y 22;

(v) eliminar los fragmentos de ADN marcados que no hibridan específicamente con los ADN de referencia;

(vi) determinar la intensidad de la señal producida por los fragmentos marcados hibridados con cada uno de los ADN de referencia seleccionados;

(vii) determinar, para cada ADN de referencia, las desviaciones entre las señales obtenidas en comparación con las obtenidas con un ADN control de un paciente sano;

(viii) derivar el estadio del cáncer del paciente de dichas desviaciones observadas para los loci 1 p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11 p, 14q22- qter, 17p, 19 y 22.

2. Un método según la reivindicación 1, caracterizado porque los ADN de referencia consisten en secuencias de ADN de cromosomas humanos con una longitud entre 1.000 y 200.000 pb (pares de bases), preferiblemente entre 2.000 y 180.000 pb, y aún más preferiblemente entre 5.000 y 160.000 pares de bases.

3. Un método según la reivindicación 2, caracterizado porque los ADN de referencia consisten en clones BAC del genoma humano.

4. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se usan un primer y un segundo marcador respectivamente para marcar los fragmentos de ADN extraídos de orina y el ADN control de un paciente sano.

5. Un método según la reivindicación 4, caracterizado porque el primer y segundo marcadores son marcadores fluorescentes que emiten a diferentes longitudes de onda, preferiblemente Cy3 y Cy5.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el grado de las células tumorales en la etapa (viii) se determina como una fundón de las desviaciones observadas respecto a los ADN de referencia.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los ADN de referencia se depositan separadamente en una micromatriz, antes de la hibridación con los fragmentos de ADN marcados.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los fragmentos de ADN tomados del paciente en la etapa (iii) se dividen en dos conjuntos, marcándose uno con un primer marcador y el segundo con un segundo marcador, dividiéndose también el ADN control de la etapa (vii) en dos conjuntos, marcándose uno con el primer marcador y el segundo con el segundo marcador, llevándose a cabo una determinación cruzada de la desviación de la señal en la etapa (vii) entre cada uno de los conjuntos así marcados.

9. Una micromatriz de ADN para la detección de cáncer de vejiga, caracterizada porque consiste en su superficie en entre 50 y 1.000 depósitos de ADN de referencia, consistiendo dichos ADN de referencia en secuencias incluidas en cada uno de los loci de cromosomas humanos: 1 p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11 q13, 12q 15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11 p, 14q22-qter, 17p, 19y22.

10. Una micromatriz de ADN según la reivindicación 9, caracterizada porque comprende entre 50 y 400, preferiblemente entre 300 y 400 de dichos depósitos de ADN de referencia en su superficie.

11. Uso del chip de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 9-11 para la detección urinaria in vitro de cáncer de vejiga.