Método para evaluar y comparar inmunorepertorios.

Un método para producir un perfil del estado inmunológico para un ser humano y/o animal,

comprendiendo el método

(a) amplificar, en una primera amplificación de PCR múltiple usando cebadores anidados específicos de diana, múltiples ADN y/o ARN de una muestra de glóbulos blancos de un sujeto humano o animal para producir múltiples primeros amplicones, comprendiendo al menos una parte de los cebadores específicos de diana interna nucleótidos adicionales para incorporar en los primeros amplicones un sitio de unión para un cebador común;

(b) separar los amplicones de los cebadores específicos de diana o diluir la mezcla de cebador específico de amplicón/diana de la primera amplificación;

(c) amplificar, en una segunda amplificación usando al menos un cebador común, los primeros amplicones para producir múltiples segundos amplicones; y

(d) secuenciar los segundos amplicones para identificar y cuantificar secuencias de ADN que representan reordenamientos para crear un perfil del estado inmunológico.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2009/040855.

Solicitante: CB Biotechnologies, Inc.

Inventor/es: HAN,JIAN.

Fecha de Publicación: 9 de Septiembre de 2015.

Clasificación Internacional de Patentes:

C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2549184_T3.pdf

Método para evaluar y comparar inmunorepertorios.

Fragmento de la descripción:

Método para evaluar y comparar inmunorepertorios

Campo de la invención 5

La invención se refiere a métodos para producir un perfil del estado inmunológico para un ser humano y/o animal.

Antecedentes de la invención 10

Los científicos han conocido durante una serie de años que ciertas enfermedades están asociadas con genes o mutaciones genéticas en particular. La causalidad genética, sin embargo, representa solamente una parte de las enfermedades diagnosticadas en seres humanos. Parecen que muchas enfermedades están unidas en cierto modo a la respuesta del sistema inmune hacia agentes ambientales e infecciosos, pero todavía se está determinando de qué modo el sistema inmune desempeña un papel en enfermedades tales como cáncer, enfermedad de Alzheimer, 15 costocondritis, fibromialgia, lupus, y otras enfermedades.

El genoma humano comprende un número total de 567-588 Ig (inmunoglobulina) y genes TR (receptores de linfocitos T) (339-354 Ig y 228-234 TR) por genoma haploide, localizados en los 7 sitios principales. Estos comprenden genes 405-418 V, 32 D, 105-109 J y 25-29 C. El número de genes de Ig y TR funcionales es 321-353 20 por genoma haploide. Estos comprenden genes 187-216 V, 28 D, 86-88 J y 20-21 C (

http://imgt.cines.fr

) . A través del reordenamiento de estos genes, se ha calculado que se pueden generar aproximadamente 2, 5 x 107 anticuerpos posibles o receptores de linfocitos T.

Aunque, al nivel de la línea germinal, los seres humanos son capaces de generar grandes números de diversas Ig y 25 TR, el número de Ig y TR disponibles para un individuo en particular es realmente mucho más pequeño debido a la selección negativa durante el desarrollo de los linfocitos B y T. En algunos individuos, este proceso puede no retirar algunas de las células que tendrían una reacción cruzada con los tejidos propios del organismo, y esta puede ser la causa de algunos tipos de enfermedades autoinmunes.

Hasta la fecha, unas pocas enfermedades se han asociado con la reacción del organismo a un antígeno común (Prinz, J. et al., Eur. J. Immunol. (1999) 29 (10) : 3360-3368, "Selection of Conserved TCR VDJ Rearrangements in Chronic Psoriatic Plaques Indicates a Common Antigen in Psoriasis Vulgaris") y/o con reordenamientos de VDJ específicos (Tamaru, J. et al., Blood (1994) 84 (3) : 708-715, "Hodgkin’s Disease with a B-cell Phenotype Often Shows a VDJ Rearrangement and Somatic Mutations in the VH Genes") . Coronella et al. (Nucleic Acids Research 35 2000, vol 28 (20) , p. e85) desvela la amplificación de VH y VL (Fab) de IgG de células individuales de plasma humano y linfocitos B. Lo que se necesita es un método mejor para evaluar cambios en las células de respuesta inmune humana y la asociación de esos cambios con enfermedades específicas.

Sumario de la Invención 40

La invención se refiere a un método para producir un perfil del estado inmunológico (ISP) para un ser humano y/o animal. En un aspecto de la invención, el método comprende las etapas de: (a) amplificar, en una primera amplificación de PCR múltiple usando cebadores anidados específicos de diana, múltiples ADN y/o ARN de una muestra de glóbulos blancos de un sujeto humano o animal para producir múltiples primeros amplicones, al menos 45 una parte de los cebadores específicos de diana interna comprendiendo nucleótidos adicionales para incorporar en los primeros amplicones un sitio de unión para un cebador común; (b) separar los amplicones de los cebadores específicos de diana o diluir la mezcla de cebador específico de amplicón/diana de la primera amplificación; (c) amplificar, en una segunda amplificación usando al menos un cebador común, los primeros amplicones para producir múltiples segundos amplicones; y (d) secuenciar los segundos amplicones para identificar y cuantificar 50 secuencias de ADN que representan reordenamientos para crear un perfil del estado inmunológico.

El ADN genómico también se puede amplificar, y la etapa de amplificación de ADN se puede sustituir por la etapa de amplificación de ARN, especialmente en casos en los que se desea el análisis de un componente del sistema tal como el complejo de histocompatibilidad (MHC) principal. 55

En algunos aspectos preferentes del método de la invención, se pueden aislar subpoblaciones de glóbulos blancos mediante citometría de flujo para separar linfocitos B sin tratamiento previo, linfocitos B maduros, linfocitos B de memoria, linfocitos T sin tratamiento previo, linfocitos T maduros, y linfocitos T de memoria. En diversos aspectos del método, las recombinaciones en la subpoblación de células son reordenamientos de moléculas I o II de cadena 60 pesada de inmunoglobulina de linfocitos B (IgH) , cadenas ligeras kappa y/o lambda (IgK, IgL) , receptores Beta, Gamma, Delta de linfocitos T, y/o Complejo de Histocompatibilidad Principal (MHC) .

En otro aspecto de la invención, el método también puede comprender la recopilación y la comparación del perfil de células inmunes para una población de individuos normales con el perfil inmune para una población de individuos 65 que han sido diagnosticados con una enfermedad para determinar si existe una correlación entre un reordenamiento o conjunto de reordenamientos específicos y la enfermedad.

También se desvela un método que comprende comparar el perfil de células inmunes identificadas para una población de individuos a los que se ha administrado una vacuna con el perfil de ser una inmune para una población 5 de individuos a los que no se ha administrado la vacuna para evaluar la eficacia de la vacuna en la producción de una respuesta inmune.

Breve Descripción de las Figuras 10

La Figura 1a y la Figura 1b son fotografías de genes que ilustran la presencia de productos de amplificación obtenidos mediante el método de la invención usando cebadores que se desvelan en el presente documento.

La Figura 2 ilustra distribuciones de uso de dominio para (a) cadena pesada de Ig en muestra de control sana, (b) cadena beta de TCR en una muestra de sangre de un paciente con cáncer de colon, (c) cadena kappa de Ig en una muestra de sangre de un paciente con Leucemia Linfocítica Crónica (CLL) , y (d) cadena lambda de Ig en una 15 muestra de sangre de un paciente con Lupus sistémico eritematoso (SLE) . Los puntos vacíos indican secuencias ausentes asociadas con combinaciones de V-J correspondientes y la altura de la columna indica la frecuencia de aparición de una secuencia en particular.

Descripción Detallada 20

El inventor ha desarrollado un método para evaluar reordenamientos de anticuerpo y receptor a partir de un gran número de células, método que es útil para comparar reordenamientos identificados en poblaciones de individuos para determinar si existe una correlación entre un reordenamiento o conjunto de reordenamientos específicos y una enfermedad, o ciertos síntomas de una enfermedad. El método también es útil para establecer una historia de la 25 respuesta inmune de un individuo o individuos como respuesta a agentes infecciosos y/o ambientales, así como para evaluar la eficacia de las vacunas.

La invención se refiere a un método para producir un perfil del estado inmunológico (ISP) para un ser humano y/o animal, método que comprende las etapas de (a) amplificar, en una primera amplificación de PCR múltiple usando 30 cebadores anidados específicos de diana, múltiples ADN y/o ARN de una muestra de glóbulos blancos de un sujeto humano o animal para producir múltiples primeros amplicones, al menos una parte de los cebadores específicos de diana interna comprendiendo nucleótidos adicionales para incorporar en los primeros amplicones un sitio de unión para un cebador común; (b) separar los amplicones de los cebadores específicos de diana o diluir la mezcla de cebador específico de amplicón/diana de la primera amplificación; (c) amplificar, en una segunda amplificación 35 usando al menos un cebador común, los primeros amplicones para producir múltiples segundos amplicones; y (d) secuenciar los segundos amplicones para identificar y cuantificar secuencias de ADN que representan reordenamientos para crear un perfil del estado inmunológico.

Cuando la expresión "que comprende" se usa en el presente documento, también se puede usar "que consiste 40 básicamente en" y "que consiste en". La expresión "perfil del estado inmunológico" pretende indicar un perfil para un individuo o población de individuos que indica la presencia y/o ausencia de secuencias que representan reordenamientos específicos que representan la diversidad de linfocitos B, linfocitos T, y/o otras células del sistema inmune humano y/o animal, así como la frecuencia de su aparición. Cuando en el presente... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Un método para producir un perfil del estado inmunológico para un ser humano y/o animal, comprendiendo el método

(a) amplificar, en una primera amplificación de PCR múltiple usando cebadores anidados específicos de diana, múltiples ADN y/o ARN de una muestra de glóbulos blancos de un sujeto humano o animal para producir múltiples primeros amplicones, comprendiendo al menos una parte de los cebadores específicos de diana interna nucleótidos adicionales para incorporar en los primeros amplicones un sitio de unión para un cebador común;

(b) separar los amplicones de los cebadores específicos de diana o diluir la mezcla de cebador específico de 10 amplicón/diana de la primera amplificación;

(c) amplificar, en una segunda amplificación usando al menos un cebador común, los primeros amplicones para producir múltiples segundos amplicones; y

(d) secuenciar los segundos amplicones para identificar y cuantificar secuencias de ADN que representan reordenamientos para crear un perfil del estado inmunológico. 15

2. El método de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente las etapas de (e) introducir las secuencias de ADN en una base de datos para proporcionar datos que se pueden almacenar en un ordenador, servidor, u otro dispositivo de almacenamiento electrónico, (f) introducir un conjunto de datos de información y características de identificación para un individuo que corresponden a las secuencias como datos que se pueden almacenar en un 20 ordenador, servidor, u otro dispositivo de almacenamiento electrónico, y (g) evaluar los datos de la etapa (e) y la etapa (f) para uno o más individuos para determinar si existe una correlación entre las secuencias y una o más características del individuo que corresponden a las secuencias.

3. El método de la reivindicación 1 en el que los cebadores específicos de diana se eligen entre el grupo que 25 consiste en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 31, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 39, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 41, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 43, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 45, 30 SEC ID Nº: 46, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº: 48, SEC ID Nº: 49, SEC ID Nº: 50, SEC ID Nº: 51, SEC ID Nº: 52, SEC ID Nº: 53, SEC ID Nº: 54, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 57, SEC ID Nº: 58, SEC ID Nº: 59, SEC ID Nº: 60, SEC ID Nº: 61, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 65, SEC ID Nº: 66, SEC ID Nº: 67, SEC ID Nº: 68, SEC ID Nº: 69, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 71, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 73, SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 76, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 80, 35 SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 82, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 84, SEC ID Nº: 85, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 87, SEC ID Nº: 88, SEC ID Nº: 89, SEC ID Nº: 90, SEC ID Nº: 101, SEC ID Nº: 102, SEC ID Nº: 103, SEC ID Nº: 104, SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 106, SEC ID Nº: 107, SEC ID Nº: 108, SEC ID Nº: 109, SEC ID Nº: 110, SEC ID Nº: 111, SEC ID Nº: 112, SEC ID Nº: 113, SEC ID Nº: 114, SEC ID Nº: 115, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 117, SEC ID Nº: 118, SEC ID Nº: 119, SEC ID Nº: 120, SEC ID Nº: 121, SEC ID Nº: 122, 40 SEC ID Nº: 123, SEC ID Nº: 124, SEC ID Nº: 125, SEC ID Nº: 126, SEC ID Nº: 127, SEC ID Nº: 128, SEC ID Nº: 129, SEC ID Nº: 130, SEC ID Nº: 131, SEC ID Nº: 132, SEC ID Nº: 133, SEC ID Nº: 134, SEC ID Nº: 135, SEC ID Nº: 136, SEC ID Nº: 137, SEC ID Nº: 138, SEC ID Nº: 139, SEC ID Nº: 140, SEC ID Nº: 151, SEC ID Nº: 152, SEC ID Nº: 153, SEC ID Nº: 154, SEC ID Nº: 155, SEC ID Nº: 156, SEC ID Nº: 157, SEC ID Nº: 158, SEC ID Nº: 159, SEC ID Nº: 160, SEC ID Nº: 161, SEC ID Nº: 162, 45 SEC ID Nº: 163, SEC ID Nº: 164, SEC ID Nº: 165, SEC ID Nº: 166, SEC ID Nº: 167, SEC ID Nº: 168, SEC ID Nº: 169, SEC ID Nº: 170, SEC ID Nº: 171, SEC ID Nº: 172, SEC ID Nº: 173, SEC ID Nº: 174, SEC ID Nº: 175, SEC ID Nº: 176, SEC ID Nº: 177, SEC ID Nº: 178, SEC ID Nº: 179, SEC ID Nº: 180, SEC ID Nº: 181, SEC ID Nº: 182, SEC ID Nº: 183, SEC ID Nº: 184, SEC ID Nº: 185, SEC ID Nº: 186, SEC ID Nº: 187, SEC ID Nº: 188, SEC ID Nº: 189, SEC ID Nº: 190, SEC ID Nº: 191, SEC ID Nº: 192, 50 SEC ID Nº: 193, SEC ID Nº: 194, SEC ID Nº: 195, SEC ID Nº: 196, SEC ID Nº: 197, SEC ID Nº: 198, SEC ID Nº: 199, SEC ID Nº: 200, SEC ID Nº: 201, SEC ID Nº: 202, SEC ID Nº: 203, SEC ID Nº: 204, SEC ID Nº: 205, SEC ID Nº: 206, SEC ID Nº: 207, SEC ID Nº: 208, SEC ID Nº: 209, SEC ID Nº: 210, SEC ID Nº: 211, SEC ID Nº: 212, SEC ID Nº: 213, SEC ID Nº: 214, SEC ID Nº: 215, SEC ID Nº: 216, SEC ID Nº: 217, SEC ID Nº: 218, SEC ID Nº: 219, SEC ID Nº: 220, SEC ID Nº: 221, SEC ID Nº: 222, 55 SEC ID Nº: 223, SEC ID Nº: 224, SEC ID Nº: 225, SEC ID Nº: 226, SEC ID Nº: 227, SEC ID Nº: 228, SEC ID Nº: 229, SEC ID Nº: 230, SEC ID Nº: 231, SEC ID Nº: 232, SEC ID Nº: 233, SEC ID Nº: 234, SEC ID Nº: 235, SEC ID Nº: 236, SEC ID Nº: 237, SEC ID Nº: 238, SEC ID Nº: 239, SEC ID Nº: 240, SEC ID Nº: 241, SEC ID Nº: 242, SEC ID Nº: 243, SEC ID Nº: 244, SEC ID Nº: 245, SEC ID Nº: 246, SEC ID Nº: 247, SEC ID Nº: 248, SEC ID Nº: 249, SEC ID Nº: 250, SEC ID Nº: 251, SEC ID Nº: 252, 60 SEC ID Nº: 253, SEC ID Nº: 254, SEC ID Nº: 255, SEC ID Nº: 256, SEC ID Nº: 257, SEC ID Nº: 258, SEC ID Nº: 259, SEC ID Nº: 260, SEC ID Nº: 261, SEC ID Nº: 262, SEC ID Nº: 263, SEC ID Nº: 264, SEC ID Nº: 265, SEC ID Nº: 266, SEC ID Nº: 267, SEC ID Nº: 268, SEC ID Nº: 269, SEC ID Nº: 270, SEC ID Nº: 271, SEC ID Nº: 272, SEC ID Nº: 273, SEC ID Nº: 274, SEC ID Nº: 275, SEC ID Nº: 276, SEC ID Nº: 277, SEC ID Nº: 278, SEC ID Nº: 279, SEC ID Nº: 280, SEC ID Nº: 281, SEC ID Nº: 282, 65 SEC ID Nº: 283, SEC ID Nº: 284, SEC ID Nº: 285, SEC ID Nº: 286, SEC ID Nº: 287, SEC ID Nº: 288, SEC ID Nº: 289, SEC ID Nº: 290, SEC ID Nº: 291, SEC ID Nº: 292, SEC ID Nº: 293, SEC ID Nº: 294, SEC ID Nº: 295, SEC ID Nº: 296, SEC ID Nº: 297, SEC ID Nº: 298, SEC ID Nº: 299, SEC ID Nº: 300, SEC ID Nº: 301, SEC ID Nº: 302, SEC ID Nº: 303, SEC ID Nº: 304, SEC ID Nº: 305, SEC ID Nº: 306, SEC ID Nº: 307, SEC ID Nº: 308, SEC ID Nº: 309, SEC ID Nº: 310, SEC ID Nº: 311 y SEC ID Nº: 312.

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