Método para detectar proBNP con un anticuerpo monoclonal.

Un anticuerpo que se fija específicamente al proBNP nativo, en el cual dicho anticuerpo que se fija específicamente al proBNP nativo es un anticuerpo monoclonal el cual se fija a péptidos sintéticos que consisten en los aminoácidos 39 a 46,

40 a 47, 41 a 48 y 42 a 49, respectivamente, de NT-proBNP y en términos de los valores de proBNP, como se determinan en muestras de pacientes que usan dicho anticuerpo se correlacionan con un valor r de al menos r≥0,95 o superior a los valores de proBNP como se determina en dichas muestras usando el anticuerpo monoclonal MAB 1.21.3 producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo DSM ACC2650 en la DSMZ, y en el cual dicho valor r se determina mediante análisis de regresión lineal.

Método para detectar proBNP con un anticuerpo monoclonal

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a una subpoblación de proBNP total llamada proBNP nativo, a un método para la detección específica de proBNP nativo, a un método para relacionar el nivel de proBNP nativo con el diagnóstico de fallo cardíaco, a un kit para la detección de proBNP nativo y a una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo del proBNP nativo.

El fallo cardíaco es un fenómeno generalizado, sobre todo en el mundo occidental. Según el diccionario médico Roche (Urban & Schwarzenberg, 1993) el fallo cardíaco es la incapacidad aguda o crónica del corazón para generar el flujo sanguíneo requerido por el metabolismo durante el ejercicio, o incluso en reposo, o para asegurar el reflujo venoso (insuficiencia cardíaca retrógrada y anterógrada). Por tanto la función de bombeo del corazón es débil. Las causas de fallo cardíaco son muy complejas. Entre otras cabe mencionar alteraciones inflamatorias y degenerativas del músculo cardíaco, trastorno de la perfusión coronaria, infarto y lesiones coronarias, que provocan modificaciones del riego sanguíneo periférico, trastornos del sistema respiratorio, de la función renal y del metabolismo electrolítico (edema) y menor rendimiento del sistema muscular del esqueleto.

Conforme a la Asociación cardíaca de Nueva York (New York Heart Association (NYHA)) la insuficiencia cardíaca se divide en las siguientes clases NYHA, mediante pruebas físicas posteriores al esfuerzo: I significa ausencia total de dolor después del esfuerzo físico normal, II significa pequeña limitación de la resistencia física, III significa fuerte limitación de la resistencia física, IV significa que los síntomas de insuficiencia aumentan con cada actividad física y también existen en reposo la mayor parte del tiempo.

Para tratar eficazmente la insuficiencia cardíaca con medicamentos del tipo de los glicósidos, vasodilatadores, inhibidores ACE y/o bloqueadores-p, primero hay que identificarla y diagnosticarla de manera exacta y correcta, clasificándola, si es posible, según el nivel de gravedad, y además controlar el curso del tratamiento.

En el estado técnico se habla de algunos marcadores séricos como posibles indicadores de un diagnóstico precoz de insuficiencia cardíaca, como por ejemplo ANP (hormona peptídica natriurética atrial) y proANP, CNP (péptido natriurétlco C), adrenomedullna, neuropéptido Y, endotellna y BNP (péptido natriurético cerebral). Teóricamente el ANP y el proANP serían marcadores adecuados para el diagnóstico de la insuficiencia cardíaca; sin embargo en la práctica no son muy estables o su vida media en la sangre es corta, lo cual supone una gran desventaja para las mediciones diagnósticas rutinarias (Buckley, M.G., y otros, Clin. Sci. 95 (1998) 235-239; Cleland, J.G., y otros, Heart 75 (1996)410-413).

Un marcador frecuentemente citado y valioso es el BNP (péptido natriurético cerebral). Al principio el BNP se detectó en el cerebro de los cerdos. Es una hormona cardíaca parecida estructural y funcionalmente al ANP (péptido natriurético atrial) (Sudoh, T., y otros, Nature 332 (1988) 78-81). El BNP humano consta de 32 aminoácidos, es secretado principalmente por los ventrículos del corazón y circula por el plasma sanguíneo humano. El uso del BNP como marcador diagnóstico es conocido por ejemplo a través de la patente EP-A-0 542 255. El BNP tiene un puente disulfuro intramolecular y no es un anallto muy estable. Ello es debido probablemente a su función fisiológica como hormona que debe descomponerse con rapidez. Por tanto su empleo como marcador diagnóstico requiere cuidado y especial atención al recoger y procesar las muestras (Masuta, C., y otros, Clin. Chem. 44 (1998) 130; Tsuji, T., y otros, Clin. Chem. 40 (1994) 672-673).

La molécula precursora del BNP, es decir el proBNP, consta de 108 aminoácidos y se divide en los 32 aminoácidos C-terminales antes citados (77-108), llamados BNP, y en los aminoácidos 1-76 N-terminales, llamados proBNP (o NT-proBNP). El BNP, el proBNP N-termlnal (1-76) y otros productos de descomposición (Hunt, P.J., y otros, Blochem. Biophys. Res. Com. 214 (1995) 1175-1183) circulan en la sangre. No está totalmente aclarado si la molécula precursora completa (proBNP 1-108) también se encuentra en el plasma. No obstante se ha descrito (Hunt, P.J.,yotros, Peptldes, vol. 18, n° 10 (1997), 1475-1481) que en el plasma se puede detectar una pequeña liberación de proBNP (1-108), aunque faltan algunos aminoácidos, debido a la descomposición parcial muy rápida en el extremo N-termlnal.

Como es sabido del estado técnico, el proBNP N-terminal (1-76) se considera un marcador de insuficiencia cardíaca.

La patente WO 93/24531 (US 5.786.163) describe un método inmunológico para identificar el proBNP N-terminal y los anticuerpos empleados para ello. En la patente WO 93/24531 se producen anticuerpos policlonales contra un único péptido derivado del proBNP N-termlnal. Se demuestra que los anticuerpos producidos se unen al péptido de Inmunización (aminoácidos 47-64) en el formato de ensayo competitivo.

En el ensayo competitivo realizado en la patente WO 93/24531 el péptido 47-64 marcado compite como trazador con proBNP en una muestra o con el péptido 47-64 estándar sin marcar, para unirse a anticuerpos policlonales de suero de conejo. Después de 48 horas solo se alcanza una competición moderada, dando como resultado un límite inferior

de detección de 250 fmol/ml, aproximadamente. Los largos tiempos de incubación de este ensayo competitivo no son aceptables para mediciones rutinarias de muestras en laboratorios automatizados.

Hunt, P.J., y otros, Clinical Endocrinology 47 (1997) 287-296, también describen un ensayo competitivo para detectar proBNP N-terminal. Este ensayo requiere una compleja extracción de la muestra de plasma antes de poder hacer las mediciones, lo cual puede provocar la destrucción del analito y mediciones erróneas. El antisuero empleado se produce análogamente a la patente WO 93/24531 por inmunización con un péptido sintético. Hunt y otros producen el antisuero por Inmunización con los aminoácidos 1-13 del proBNP N-terminal, usando como patrón un péptido con los aminoácidos 1-21. Para este ensayo también se necesitan tiempos de incubación largos. Tras 24 de incubación se alcanza un limite Inferior de detección de 1,3 fmol/ml.

Ng, L., y otros, WO 00/35951, describen otro método para diagnosticar proBNP N-terminal. Este método se basa en el uso de anticuerpos concebidos contra un péptido sintético que corresponde a los aminoácidos 65 hasta 76 del proBNP humano.

Hughes, D., y otros, Clin. Sel. 96 (1999) 373-380, Informan de dos diferentes ensayos para el proBNP N-terminal. En un primer ensayo se usa un anticuerpo pollclonal generado por un inmunógeno que comprende un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 65-76 del proBNP, mientras que en un segundo ensayo el anticuerpo policlonal se genera de modo análogo, pero a los aminoácidos 37-49. Según los datos producidos por Hughes, D., y otros, un anticuerpo generado y reactivo con el péptido correspondiente a los aminoácidos 37-49 del proBNP no reacciona con proBNP endógeno intacto. Un ensayo basado en este último no discrimina entre pacientes con disfunción ventricular izquierda y controles normales. Con el ensayo basado en proBNP 65-76 se pudo discriminar claramente el mismo grupo de pacientes.

Goetze, J.P. y otros, Clin. Chem. 48 (2002) 1035-1042, describen un ensayo para los aminoácidos más N-terminales (1-21) del proBNP N-terminal. Su ensayo se basa en un anticuerpo policlonal concebido contra un péptido sintético correspondiente a los mismos aminoácidos (1-21) del proBNP.

El ensayo antedicho de Goetze, J.P. y otros requiere la digestión completa de la muestra y los distintos proBNPs que comprende. Se dice que este ensayo también fue eficiente para reducir la fijación ¡nespeclfica.

Karl, J. y otros, WO 00/45176, demostraron por primera vez que la detección sensible y rápida de proBNP N-terminal también es posible en un inmunoensayo sándwich. Tal como está descrito en la patente WO 00/45176 los epítopos preferidos se hallan entre los aminoácidos 10 y 50 del proBNP N-terminal.

La patente US 2003/0219734 se refiere al hecho de que en una muestra pueden estar presentes varios polipéptidos distintos, derivados del proBNP (1-108), del BNP (77-108), así como del proBNP N-terminal (1-76).

Mair, J., y otros, Clin. Chem. Lab. Med. 39 (2001) 571-588, han resumido el impacto de la determinación de péptidos natriuréticos cardíacos en el diagnóstico y control del fallo cardíaco. Resaltan que los... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo que se fija específicamente al proBNP nativo, en el cual dicho anticuerpo que se fija específicamente al proBNP nativo es un anticuerpo monoclonal el cual se fija a péptidos sintéticos que consisten en los aminoácidos 39 a 46, 40 a 47, 41 a 48 y 42 a 49, respectivamente, de NT-proBNP y en términos de los valores de proBNP, como se determinan en muestras de pacientes que usan dicho anticuerpo se correlacionan con un valor r de al menos r=0,95 o superior a los valores de proBNP como se determina en dichas muestras usando el anticuerpo monoclonal MAB 1.21.3 producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo DSM ACC2650 en la DSMZ, y en el cual dicho valor r se determina mediante análisis de regresión lineal.

2. Un método para la detección específica de proBNP nativo in vitro, que comprende las etapas de

poner en contacto una muestra, que se sospecha o que se sabe que contiene proBNP, con un anticuerpo de proBNP nativo según la reivindicación 1, en condiciones que permitan la formación de un complejo anticuerpo de proBNP-proBNP nativo y detectar el complejo formado.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, por el cual la detección se lleva a cabo mediante un inmunoensayo competitivo.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, por el cual dicha detección se realiza mediante un inmunoensayo sándwich, por el cual se usa además un segundo anticuerpo para proBNP y por el cual tanto dicho segundo anticuerpo de proBNP como el anticuerpo de proBNP nativo se fijan a proBNP nativo formando así un segundo complejo anticuerpo de anticuerpo-proBNP nativo-anti-proBNP nativo.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, por el cual el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en MAB 17.3.1, MAB 18.4.34 y MAB 18.29.23, respectivamente, producidos por las líneas celulares de hibridoma depositadas en la DSM bajo DSM ACC 2591, DSM ACC 2592 y DSM ACC 2593, respectivamente.

6. Un método para diferenciar in vitro las fases de NYHA 0 y I de las fases II, III y IV que comprende la detección específica de proBNP nativo usando un anticuerpo según la reivindicación 1 y correlacionando el nivel de proBNP nativo con insuficiencia cardíaca.

7. Un kit para medir proBNP nativo, que comprende un anticuerpo según la reivindicación 1 y reactivos auxiliares para la detección de proBNP nativo.