Método isotérmico rápido altamente sensible para la detección de mutaciones puntuales y SNP, conjunto de cebadores y kit para el mismo.

Método de detección de la presencia de una mutación puntual en una molécula de ácido nucleico diana en un contexto de moléculas de ácido nucleico de tipo natural,

comprendiendo el método las etapas de:

1) proporcionar una muestra de ácido nucleico;

2) poner en contacto dicha muestra de ácido nucleico, en condiciones de reacción apropiadas, con una disolución que comprende una mezcla de oligonucleótidos y una ADN polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de hebra en condiciones de hibridación, en el que dicha mezcla de oligonucleótidos consiste en cebadores adecuados para amplificación isotérmica mediada por bucle de la región de la molécula de ácido nucleico diana que incluye la posición de ácido nucleico de la mutación puntual que va a detectarse, comprendiendo dichos cebadores:

i. un primer cebador externo F3 y un segundo cebador externo B3;

ii. un primer cebador interno FIP y un segundo cebador interno BIP,

en el que FIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3' F2 y una secuencia de ácido nucleico en 5' F1c y

BIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3' B2 y una secuencia de ácido nucleico en 5' B1c,

en el que F2 puede reconocer e hibridarse con una región de la molécula de ácido nucleico diana designada como F2c y B2 puede reconocer e hibridarse con una región de la molécula de ácido nucleico diana designada como B2c, en el que F2c y B2c son regiones diferentes ubicadas en hebras opuestas de la molécula de ácido nucleico diana,

en el que o bien B2c está en el sentido de 3' de la mutación puntual o bien F2c está en el sentido de 5' de 30 la mutación puntual, y en el que si B2c está en el sentido de 3' de la mutación puntual, entonces dicha mutación puntual está ubicada en la secuencia de F2c o en el sentido de 3' de la secuencia de F2c y en el sentido de 5' de la secuencia de F1c,

o si F2c está en el sentido de 5' de la mutación puntual, entonces dicha mutación puntual está ubicada en la secuencia de B2c o en el sentido de 5' de la secuencia de B2c y en el sentido de 3' de la secuencia de B1c;

iii. un cebador extensible mutante de tallo-bucle que comprende:

- una secuencia de bucle central que puede reconocer e hibridarse selectivamente con una región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual, de manera que la secuencia de bucle central puede reconocer e hibridarse con la molécula de ácido nucleico diana sólo si está presente la mutación puntual, y

- una secuencia de extremo 5' y una secuencia de extremo 3' que son complementarias entre sí de manera que se forma un tallo tras hibridación intramolecular,

siendo la afinidad de hibridación de la secuencia de bucle central con la región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual mayor que la afinidad de hibridación intramolecular de la secuencia en 5' con la secuencia en 3' de manera que, si está presente la mutación puntual, la secuencia de bucle central se aparea con y amplifica la región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual;

iv. un resto no extensible que puede reconocer e hibridarse selectivamente con las moléculas de ácido nucleico de tipo natural;

3) incubar la mezcla resultante a una temperatura constante;

4) detectar una señal indicativa de amplificación de la región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual.

Método isotérmico rápido altamente sensible para la detección de mutaciones puntuales y SNP, conjunto de cebadores y kit para el mismo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para detectar una mutación puntual o un SNP en una secuencia de nucleótidos por medio de un método de amplificación por LAMP (polimerización mediada por amplificación por bucle) mejorado, así como a un conjunto de cebadores y a un kit para llevar a cabo el método de la invención. Según una realización no limitativa, el método, el conjunto de cebadores y el kit son adecuados para detectar la mutación G1849T (V617F) en el gen JAK2.

Antecedentes de la invención

Los trastornos mieloproliferativos (MPD) son trastornos clónales de progenitores hematopoyéticos, e incluyen los MPD clásicos leucemia mieloide crónica (CML), policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (ET) y mielofibrosis primaria (PMF), así como leucemia eosinófila crónica (CEL), leucemia mielomonocítica crónica (CMML) y mastocitosis sistémica (SM) y otros. En las últimas dos décadas, se han identificado alelos mutantes en CML, CMML, CEL y SM2-5, y en cada caso la mutación causante da como resultado la activación constitutiva de la señalización por tirosina cinasa. Las causas genéticas de los MPD más comunes siguieron siendo desconocidas hasta la identificación de mutaciones que activan la señalización por la cinasa Janus 2 (JAK2) en la mayoría de los pacientes con PV, ET o PMF(1, 2, 3, 4). JAK2 es un miembro de la familia Janus de tirosina cinasas no receptoras citoplasmáticas, que también incluye JAK1, JAK3 y TYK2. La mutación es una sustitución de guanina a timidina en la posición 1849 en la secuencia codificante de JAK2 (n.2 de registro de GenBank NM 4972, SEQ ID NO: 1), comenzando la numeración en el codón de iniciación ATG, correspondiente a la posición 2343 de SEQ ID NO: 1. Una mutación de este tipo da como resultado una sustitución de fenilalanina por valina en el aminoácido 617 de la proteína JAK2 (JAK2V617F), dentro del dominio pseudocinasa JH2 (5). La pérdida de autoinhibición de JAK2 da como resultado la activación constitutiva de la cinasa, de manera análoga a otras mutaciones en MPD y leucemia que activan de manera aberrante tirosina cinasas (6, 7, 8).

La secuenciación directa sólo es sensible hasta aproximadamente el 2% del ADN mutante en un contexto de tipo natural (9, 1). Esta cuestión es bastante relevante para trastornos mieloides crónicos, en los que la sangre y la médula están compuestas a menudo por una mezcla de elementos hematopoyéticos normales residuales y neoplásicos. Éste es especialmente el caso de ET y MDS, en los que pueden estar presentes mutaciones génicas evidentes fenotípicamente en clones diminutos que comprenden menos del 1% de la población de células de médula total. James et al. (11) investigaron esta cuestión específicamente con respecto a 1849 G-T de JAK2 realizando una serie de experimentos de mezclado con células de eritroleucemia HEL, que portan la mutación de JAK2, mezcladas con células de eritroleucemia TF-1, que no la portan. No pudieron detectar el alelo mutado cuando estaba presente en <5% del ADN total. Con ADN de paciente mutante homocigoto diluido en ADN de una persona sana, la secuenciación era incluso menos sensible (1%) de lo que era con las líneas celulares (12).

Un método común usado para la detección de mutaciones de ácidos nucleicos es el sistema de amplificación resistente a la amplificación (ARMS). Se aprovecha del hecho de que los cebadores de oligonucleótidos deben aparearse perfectamente en sus extremos 3 para que una ADN polimerasa extienda estos cebadores durante la PCR (12). Diseñando cebadores de oligonucleótidos que se aparean sólo con una mutación puntual del ADN específica, tal como la que codifica para V617F de JAK2, ARMS puede distinguir entre alelos polimórficos. Por tanto, a estas técnicas se les dan los nombres alternativos de "PCR específica de alelo" (AS-PCR) o "PCR de cebador específico de secuencia". La sensibilidad de ARMS es de hasta del 1 al 2% (13) de ADN mutante en un contexto de tipo natural.

La monitorización en tiempo real de la acumulación de productos de PCR durante el termociclado puede ser valiosa como método semicuantitativo y pueden usarse ensayos de curvas de fusión de ADN conjuntamente con PCR en tiempo real. Asimismo, James et al. (14) compararon la secuenciación mediante química de colorantes fluorescentes con dos sistemas de detección de mutaciones basados en PCR en tiempo real diferentes, uno que usaba un instrumento LightCycler (Roche Diagnostics) y otro que usaba una máquina Taqman ABI Pñsm 75 (Applied Biosystems). Estas técnicas de PCR en tiempo real detectaron del ,5 al 1% de ADN de la línea celular HEL diluido en ADN de la línea celular TF-1 y del 2 al 4% de ADN de paciente mutado de manera homocigota diluido en ADN de una persona sana.

Es posible un análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) puesto que la mutación 1849 G-T de JAK2 suprime un motivo en la secuencia de JAK2 de tipo natural que se reconoce por la enzima de restricción BsaXI. Aunque la supresión de un sitio de restricción no es tan satisfactoria como la creación de un nuevo sitio, debido a que una reacción de escisión enzimática negativa podría deberse o bien a la ausencia de la mutación o bien a un fallo del procedimiento de digestión, puede ser útil como análisis de primer paso. La sensibilidad proporcional notificada depende en parte del método usado para detectar los fragmentos y es de aproximadamente

el 2% de ADN muíante en un contexto de tipo natural (15, 16).

La pirosecuenciación es un método de genotipado rápido que depende de la liberación de pirofosfato (PPi) siempre que se incorpore un dNTP a una cadena de ADN en crecimiento durante la polimerización de ADN dirigida por molde (17). Varios grupos (17, 18) han intentado la pirosecuenciación de JAK2 usando el sistema automatizado PSQ HS 96 (Biotage, Uppsala, Suecia) con experimentos de dilución similares a los descritos anteriormente mostrando una sensibilidad del ensayo notificada del 5 al 1% de alelo muíante en un contexto de tipo natural.

Se han descrito otras varias técnicas de detección de mutaciones, incluyendo análisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP), electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), cromatografía de líquidos de alta resolución desnaturalizante (DHPLC), ensayos de extensión de cebador de un solo nucleótido (Pronto), y otros. De hecho, la DHPLC puede detectar la mutación de ADN genómico que subyace a V617F de JAK2 de manera fiable, y puede detectar mutaciones a una proporcionalidad de <1 al 2%. Sin embargo, la DHPLC y las otras técnicas o bien suponen un desafío técnico o bien requieren mucha mano de obra o ambos. O bien no permiten una alta producción a un coste adecuado para un laboratorio clínico (SSCP y DGGE) o bien requieren una inversión inicial considerable en equipo (DHPLC).

Teóricamente, también podrían usarse técnicas basadas en proteínas para detectar la mutación V617F de JAK2, pero éstas son generalmente engorrosas, y el acceso a tales recursos es limitado. Por tanto, habitualmente no se prefieren ensayos basados en proteínas si son viables pruebas basadas en ADN o ARN.

La solicitud de patente europea EP1692281A da a conocer un método para la detección de la mutación G1849T de JAK2 basándose en amplificación por PCR.

Los documentos de la técnica anterior W29/4963, Nagamina et al, (Molecular and Cellular Probes (22) 16, 223-229), US27/218464 y EP1975249 dan a conocer métodos de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que emplean además de los cebadores externos F3 y B3, los cebadores internos FIP y BIP y también los cebadores de bucle LB o LF.

Los métodos de la técnica anterior muestran varias limitaciones. En primer lugar, el menor nivel de sensibilidad, que permite la detección de la secuencia de JAK2 mutante hasta el 1% de la muestra en los mejores casos. Una sensibilidad de este tipo requiere el enriquecimiento de los mutantes por medio de aislamiento de granulocitos antes de la extracción. Ésta es una etapa que requiere mucho tiempo y mano de obra que da como resultado aproximadamente 2 horas adicionales para los procedimientos ya largos (de desde 2 hasta 5 horas) requeridos para el diagnóstico. Además, todos los métodos ilustrados anteriormente son relativamente caros y requieren mucha mano de obra, requiriendo a menudo equipo especializado que no siempre está fácilmente disponible.

Descripción de la invención

Los presentes inventores han establecido un método de LAMP novedoso de detección de una mutación... [Seguir leyendo]

Método de detección de la presencia de una mutación puntual en una molécula de ácido nucleico diana en un contexto de moléculas de ácido nucleico de tipo natural, comprendiendo el método las etapas de:

1) proporcionar una muestra de ácido nucleico;

2) poner en contacto dicha muestra de ácido nucleico, en condiciones de reacción apropiadas, con una disolución que comprende una mezcla de oligonucleótidos y una ADN polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de hebra en condiciones de hibridación, en el que dicha mezcla de oligonucleótidos consiste en cebadores adecuados para amplificación isotérmica mediada por bucle de la región de la molécula de ácido nucleico diana que incluye la posición de ácido nucleico de la mutación puntual que va a detectarse, comprendiendo dichos cebadores:

i. un primer cebador externo F3 y un segundo cebador externo B3;

¡i. un primer cebador interno FIP y un segundo cebador interno BIP,

en el que FIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3 F2 y una secuencia de ácido nucleico en 5 F1c y BIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3 B2 y una secuencia de ácido nucleico en 5 B1c,

en el que F2 puede reconocer e hibridarse con una región de la molécula de ácido nucleico diana designada como F2c y B2 puede reconocer e hibridarse con una región de la molécula de ácido nucleico diana designada como B2c,

en el que F2c y B2c son regiones diferentes ubicadas en hebras opuestas de la molécula de ácido nucleico diana,

en el que o bien B2c está en el sentido de 3 de la mutación puntual o bien F2c está en el sentido de 5 de la mutación puntual, y en el que si B2c está en el sentido de 3 de la mutación puntual, entonces dicha mutación puntual está ubicada en la secuencia de F2c o en el sentido de 3 de la secuencia de F2c y en el sentido de 5 de la secuencia de F1c, o

si F2c está en el sentido de 5 de la mutación puntual, entonces dicha mutación puntual está ubicada en la secuencia de B2c o en el sentido de 5 de la secuencia de B2c y en el sentido de 3 de la secuencia de

B1c;

iii. un cebador extensible mutante de tallo-bucle que comprende:

- una secuencia de bucle central que puede reconocer e hibridarse selectivamente con una región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual, de manera que la secuencia de bucle central puede reconocer e hibridarse con la molécula de ácido nucleico diana sólo si está presente la mutación puntual, y

- una secuencia de extremo 5 y una secuencia de extremo 3 que son complementarias entre sí de manera que se forma un tallo tras hibridación intramolecular,

siendo la afinidad de hibridación de la secuencia de bucle central con la región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual mayor que la afinidad de hibridación intramolecular de la secuencia en 5 con la secuencia en 3 de manera que, si está presente la mutación puntual, la secuencia de bucle central se aparea con y amplifica la región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual;

iv. un resto no extensible que puede reconocer e hibridarse selectivamente con las moléculas de ácido nucleico de tipo natural;

3) incubar la mezcla resultante a una temperatura constante;

4) detectar una señal indicativa de amplificación de la región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual.

Método según la reivindicación 1, en el que la mutación puntual está ubicada en la región entre la secuencia de F2c y la secuencia de F1c o entre la secuencia de B2c y la secuencia de B1c.

Método según la reivindicación 1, en el que la mutación puntual está ubicada en la secuencia de F2c o en la

6. 7.

8.

9.

1.

11.

12.

13.

14.

secuencia de B2c.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada una de la secuencia de extremo 5 y la secuencia de extremo 3 del cebador extensible mutante de tallo-bucle tiene al menos 3 nucleótidos de longitud.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el resto no extensible es un ácido nucleico peptídico (PNA).

Método según la reivindicación 5, en el que el PNA tiene al menos 1 bases de longitud.

Método según la reivindicación 5 ó 6, en el que la secuencia de bases de PNA es tal que la temperatura de fusión de la estructura bicatenaria que resulta de la hibridación del PNA con la molécula de ácido nucleico diana en ausencia de la mutación puntual (Tf = X) es mayor que la temperatura de incubación y la temperatura de fusión de la estructura bicatenaria que resulta de la hibridación del PNA con la molécula de ácido nucleico diana en presencia de la mutación puntual (Tf = Y) es menor que la temperatura de incubación, y además en el que X es al menos 52C mayor que Y.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el resto no extensible es un cebador no extensible de tipo natural de tallo-bucle, que comprende:

- una secuencia de bucle central que puede reconocer e hibridarse selectivamente con una región de la molécula de ácido nucleico de tipo natural que comprende la posición de ácido nucleico de la mutación puntual que va a detectarse;

- una secuencia de extremo 5 y una secuencia de extremo 3 que son complementarias entre sí de manera que se forma un tallo tras hibridación intramolecular,

siendo la afinidad de hibridación de la secuencia de bucle central con la región de la molécula de ácido nucleico de tipo natural que comprende la posición de ácido nucleico de la mutación puntual que va a detectarse mayor que la afinidad de hibridación intramolecular de la secuencia de extremo 5 con la secuencia de extremo 3, de manera que la secuencia de bucle central se aparea con la región de la molécula de ácido nucleico de tipo natural que comprende la posición de ácido nucleico de la mutación puntual que va a detectarse, bloqueando de ese modo la amplificación.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la ADN polimerasa se selecciona del grupo que consiste en Bst polimerasa de fragmento grande, Bca (exo-), Vent, Vent (exo-), Deep Vent, Deep Vent (exo-), fago <í>29, fago MS-2, Z-Taq, KOD, fragmento Klenow y cualquier combinación de los mismos.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la mutación puntual que va a detectarse es la mutación g > t en la posición 2343 de SEQ ID NO: 1.

Método según la reivindicación 1, en el que el primer cebador externo F3 consiste en SEQ ID NO: 3, el segundo cebador externo B3 consiste en SEQ ID NO: 4, el primer cebador interno FIP consiste en SEQ ID NO: 5, el segundo cebador interno BIP consiste en SEQ ID NO: 6 y el cebador extensible mutante de tallo- bucle consiste en SEQ ID NO: 8.

Método según la reivindicación 11, que comprende además un resto no extensible que es un PNA que tiene la siguiente secuencia de bases: NH2-GAGTATGTGTCTGTGGA-COOH (SEQ ID NO: 9), en la que G es guanina, A es adenina, T es timina y C es citosina.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además la etapa de evaluar si la mutación puntual está en forma homocigota o heterocigota, comparando cuantitativamente la señal indicativa de amplificación de la región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual obtenida a partir de la muestra con dicha señal obtenida a partir de al menos un calibrador.

Método según la reivindicación 13, en el que el al menos un calibrador consiste en un porcentaje predeterminado (%) de moléculas de ácido nucleico diana mutantes en un contexto de moléculas de ácido nucleico de tipo natural, en el que dicho porcentaje predeterminado (%) es preferiblemente de aproximadamente el 1%.

Conjunto de cebadores para detectar, mediante amplificación isotérmica mediada por bucle, la presencia de una mutación puntual en una molécula de ácido nucleico diana en un contexto de moléculas de ácido nucleico de tipo natural, comprendiendo el conjunto de cebadores:

i. un primer cebador externo F3 y un segundo cebador externo B3;

16.

17.

18.

19. 45

21.

22.

¡i. un primer cebador interno FIP y un segundo cebador interno BIP,

en el que FIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3 F2 y una secuencia de ácido nucleico en 5 F1c y BIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3 B2 y una secuencia de ácido nucleico en 5 B1c,

en el que F2 es complementaria una región de la molécula de ácido nucleico diana designada como F2c y B2 es complementaria a una región de la molécula de ácido nucleico diana designada como B2c,

en el que F2c y B2c son regiones no solapantes ubicadas en hebras opuestas de la molécula de ácido nucleico diana,

en el que o bien B2c está en el sentido de 3 de la mutación puntual o bien F2c está en el sentido de 5 de la mutación puntual, y en el que si B2c está en el sentido de 3 de la mutación puntual, entonces dicha mutación puntual está ubicada en la secuencia de F2c o entre la secuencia de F2c y la secuencia de F1c, o

si F2c está en el sentido de 5 de la mutación puntual, entonces dicha mutación puntual está ubicada en la secuencia de B2c o entre la secuencia de B2c y la secuencia de B1c;

¡II. un cebador extensible mutante de tallo-bucle que comprende:

- una secuencia de bucle central complementaria a una región de una molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual, y

- una secuencia de extremo 5 y una secuencia de extremo 3 que son complementarias entre sí de manera que se forma un tallo tras hibridación intramolecular,

siendo la afinidad de hibridación de la secuencia de bucle central con la región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación mayor que la afinidad de hibridación intramolecular de la secuencia en 5 con la secuencia en 3.

Conjunto de cebadores según la reivindicación 15, en el que cada una de la secuencia de extremo 5 y la secuencia de extremo 3 del cebador extensible mutante de tallo-bucle tiene al menos 3 nucleótidos de longitud.

Conjunto de cebadores según la reivindicación 15 ó 16, que comprende además un resto no extensible que puede hibridarse con las moléculas de ácido nucleico de tipo natural.

Conjunto de cebadores según la reivindicación 17, en el que el resto no extensible es un ácido nucleico peptídico (PNA).

Conjunto de cebadores según la reivindicación 18, en el que el PNA tiene al menos 1 bases de longitud.

Conjunto de cebadores según la reivindicación 15 ó 16, en el que el resto no extensible es un cebador no extensible de tallo-bucle, que comprende:

- una secuencia de bucle central complementaria a una región de las moléculas de ácido nucleico de tipo natural que comprende la posición de ácido nucleico de la mutación puntual que va a detectarse;

- una secuencia de extremo 5 y una secuencia de extremo 3 que son complementarias entre sí de manera que se forma un tallo tras hibridación intramolecular,

siendo la afinidad de hibridación de la secuencia de bucle central con la región de las moléculas de ácido nucleico de tipo natural que comprende la posición de ácido nucleico de la mutación puntual que va a detectarse mayor que la afinidad de hibridación intramolecular de la secuencia de extremo 5 con la secuencia de extremo 3.

Conjunto de cebadores según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 2, en el que el primer cebador externo F3 consiste en SEQ ID NO: 3, el segundo cebador externo B3 consiste en SEQ ID NO: 4, el primer cebador interno FIP consiste en SEQ ID NO: 5, el segundo cebador interno BIP consiste en SEQ ID NO: 6 y el cebador extensible mutante de tallo-bucle consiste en SEQ ID NO: 8.

Conjunto de cebadores según la reivindicación 21, que comprende además un resto no extensible que es un PNA que tiene la siguiente secuencia de bases: NH2-GAGTATGTGTCTGTGGA-COOH (SEQ ID NO: 9),

en la que G es guanina, A es adenina, T es timina y C es citosina.

23. Kit para detectar, mediante amplificación isotérmica mediada por bucle, la presencia de una mutación puntual en una molécula de ácido nucleico diana en un contexto de moléculas de ácido nucleico de tipo

natural, comprendiendo el kit el conjunto de cebadores según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22 y

una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra.

24. Kit según la reivindicación 23, en el que la ADN polimerasa se selecciona del grupo que consiste en Bst polimerasa de fragmento grande, Bca (exo-), Vent, Vent (exo-), Deep Vent, Deep Vent (exo-), fago <t>29,

fago MS-2, Z-Taq, KOD, fragmento Klenow y cualquier combinación de los mismos.

25. Kit según la reivindicación 23 ó 24, que comprende además uno o más calibradores.