Método de selección de anticuerpos específicos de merluza europea (Merluccius merluccius) para asignar individuos a sus poblaciones según sean de origen Atlántico o de origen Mediterráneo.

Método de selección de anticuerpos específicos de merluza europea (Merluccius merluccius) para asignar individuos a sus poblaciones según sean de origen Atlántico o de origen Mediterráneo.

La presente invención se refiere a un método para seleccionar péptidos a partir de proteínas de tejidos u órganos de merluza europea para producir anticuerpos específicos con los que identificar la procedencia de los individuos de merluza europea, asignándolos a la cuenca mediterránea o a la cuenca atlántica. Partiendo de cerebro, se han seleccionado péptidos localizados en las proteínas: ATP sintetasa, subunidad alfa; 14-3-3; y de canal de aniones dependiente de voltaje, respectivamente. Así mismo, la invención incluye la combinación de anticuerpos frente a los péptidos seleccionados, con los que se ha diseñado un método de inmunodetección para identificar las poblaciones de origen de la merluza europea. Con los anticuerpos producidos, la invención presenta también un kit de identificación del origen de las merluzas.

Método de selección de anticuerpos específicos de merluza europea (Merluccius merluccius) para asignar individuos a sus poblaciones según sean de origen Atlántico o de origen Mediterráneo Sector de la Técnica La presente invención guarda relación con anticuerpos específicos frente a merluza (Merluccius merluccius) como herramientas de discriminación de sus poblaciones según su origen de procedencia (cuenca mediterránea o atlántica) . La evaluación de dicha capacidad discriminante se basa en el análisis cuantitativo de los niveles de expresión de los antígenos de muestras de individuos de merluza capturados en ambas cuencas frente a dichos anticuerpos. La invención puede ser empleada en formato de análisis de diagnóstico basados en técnicas de inmunodetección.

Estado de la técnica En la actualidad, existe un aumento en la necesidad de desarrollar herramientas de trazabilidad, tanto de pescados como de productos de pescado procesado, para la protección del consumidor final y como marco legal de trabajo para la aplicación de normativas y leyes que reduzcan la pesca ilegal, incontrolada y no regulada (IUU) . Estas herramientas de trazabilidad no sólo se enfocan en determinar la especie de pescado sino también el origen de la captura. Así pues, pescados o productos de pescado procesado que estén mal etiquetados, en los cuales se indique de forma incorrecta el origen de pesca, suponen un efecto negativo indirecto en la gestión de las poblaciones o stocks de pesca, cuya consecuencia final puede constituir el agotamiento de sus recursos (Stokstad, E. 2010, Science, 330:1468-1469) . En este contexto, la lucha contra la pesca IUU es una prioridad para la Unión Europea (UE) , debido a la grave amenaza que representa globalmente para los ecosistemas marinos y la sostenibilidad de la pesca mundial.

La merluza europea (Mer/uccius merluccius, Linnaeus, 1758) constituye una especie de alto interés pesquero dentro de la UE y se explota para la pesca a lo largo de toda su distribución. La merluza europea está distribuida geográficamente desde el Océano Atlántico occidental (aproximadamente desde los 62°N, cerca de las islas Shetland, incluyendo los fiordos Noruegos, hasta los 23°N en Mauritania) hasta el Mar Mediterráneo.

La gestión de la explotación de las poblaciones de merluza europea es llevada a cabo por el Consejo Internacional para la Exploración del Mar (CIEM; en inglés, Internatianal Cauncil far the Explaratian af the Seas, ICES) y la Comisión General de Pesca del Mediterráneo (CGPM; en inglés, General Fisheries Cammissian far the Mediterranean, GFCM) . Dentro de la UE, España es el mayor productor de merluza, con más de 23.000 toneladas de capturas (FAO, 2012, FAO yearbaak. Fisheries and Aquaculture Statistics 2010) . Se considera que las poblaciones de merluza del Noroeste Atlántico se encuentran sobreexplotadas (Murua, 2010, Advances in Marine Biology, 58: 97-154) . Es por ello que estas organizaciones han expresado la necesidad de mantener la biomasa de dichas poblaciones a un nivel que permita su explotación sostenible de acuerdo con el máximo rendimiento sostenible (ICES, www.ices.dk) . Para ello resulta necesaria una correcta determinación

del origen de las capturas que permita controlar el tráfico ilegal de las

poblaciones.

Los microsatélites constituyen las moléculas más utilizadas como

herramientas de trazabilidad y para el análisis de diversidad genética y determinación de la estructuración de las poblaciones de merluza. Estudios basados en la utilización de estos marcadores han podido diferenciar a escala macro-geográfica dos stock s o poblaciones de merluza genéticamente diferentes, uno correspondiente al Océano Atlántico y otro al Mar Mediterráneo, con la zona de contacto situada en la costa cercana a Almería y Orán (Lundy et aL, 1999, Molecular Ecology 8: 1889-1898) . Sin embargo, los microsatélites presentan limitaciones de calibración y reproducibilidad entre laboratorios y no suelen utilizarse como instrumento de control.

Con la caracterización de anticuerpos específicos de merluza europea capaces de asignar muestras de merluza con suficiente precisión mediante análisis por inmunoensayo, se abre un posible marco legal de trabajo para la aplicación de normativas y leyes que reduzcan la pesca IUU. Sin embargo, hasta la fecha no se ha descrito la existencia de estos anticuerpos ni su capacidad discriminatoria mediante una técnica de inmunoensayo.

Descripción detallada de la invención Método de selección de anticuerpos específicos de merluza europea (Merluccius merluccius) para asignar individuos a sus poblaciones según sean de origen Atlántico o de origen Mediterráneo La presente invención se refiere a un método de selección y posterior aplicación de anticuerpos específicos de merluza europea (Merluccius merluccius) como herramientas de discriminación de sus poblaciones según su origen de procedencia (cuenca mediterránea o atlántica) , mediante técnicas de inmunodetección. En extractos crudos de tejidos u órganos de merluza europea se identifican proteínas con diferente nivel de expresión, utilizando anticuerpos policlonales específicos frente a péptidos presentes en las proteínas en cuestión de esta especie. Posteriormente, en base al análisis estadístico de los niveles de expresión, es posible clasificar una muestra de merluza como procedente de la región atlántica o de la región mediterránea.

En un primer aspecto de la invención se presenta un método en el que se aplican distintos criterios de selección de péptidos que, posteriormente, se utilizan para la producción de anticuerpos específicos frente a Merluccius merluccius. La utilización de varios criterios en la selección de los péptidos que han servido como antígenos en esta invención ha llevado a obtener

resultados con un poder de discriminación muy superior a la utilización de esos mismos criterios por separado.

En primer lugar, el método incluye el análisis de la expresión de proteínas de tejidos u órganos de merluza europea en individuos procedentes del Océano Atlántico y en individuos procedentes del Mar Mediterráneo. A continuación, se han seleccionado aquellas proteínas cuyos niveles de expresión son diferentes en los individuos procedentes del Océano Atlántico con respecto a los individuos procedentes del Mar Mediterráneo y se han identificado dichas proteínas. En una realización preferida de la invención, el órgano utilizado ha sido el cerebro y las proteínas seleccionadas han sido: la proteína ATP sintetasa, subunidad alfa de 60 kOa, caracterizada por SEO ID NO: 1; la proteína 14-3-3 de 28 kOa, caracterizada por SEO ID NO: 2; y la proteína de canal de aniones dependiente de voltaje de 30 kOa, caracterizada por SEO ID NO: 3. A partir de estas proteínas se han identificado las secuencias de aminoácidos que se predicen como constituyentes de segmentos en a-hélice transmembrana expuestos a la matriz extracelular y se han producido anticuerpos específicos frente a las secuencias de aminoácidos de dichos segmentos extracelulares.

De esta forma, se han determinado tres péptidos que se han utilizado para la producción de anticuerpos con capacidad de discriminación de las poblaciones de merluza europea. Estos péptidos están caracterizados por SEO ID NO: 4, SEO ID NO: 5 y SEO ID NO: 6.

Así mismo, el método puede incluir la adición de 1 o 2 aminoácidos y/o moléculas a los péptidos seleccionados, con el objetivo de aumentar su capacidad inmunogénica.

La invención también incluye combinaciones de anticuerpos específicos de merluza europea para asignar individuos a sus poblaciones según sean de origen Atlántico o de origen Mediterráneo que incluyen uno o más anticuerpos generados según el método que se acaba de describir. Estas combinaciones pueden incluir uno o varios de los anticuerpos específicos generados frente a los péptidos caracterizados por SEa ID NO: 4, SEa ID NO: 5 y/o SEa ID NO: 6 que, además, pueden incluir 1 o 2 aminoácidos y/o moléculas, con el objetivo de aumentar su capacidad inmunogénica.

En otro aspecto de la invención, se presenta un método de clasificación de muestras de extracto proteico de merluza en poblaciones del Atlántico o del Mediterráneo que comprende la detección y cuantificación de antígenos correspondientes a proteínas de la especie Merluccius merluccius, mediante técnicas de inmunodetección a partir de los anticuerpos generados en la presente invención, y la cuantificación de los niveles de expresión de las correspondientes proteínas. Los análisis de los niveles de expresión para cada proteína resultan ser diferentes significativamente y característicos de poblaciones del Mediterráneo o del Atlántico.... [Seguir leyendo]

1. Combinación de anticuerpos específicos de merluza europea (Merluccius merluccius) para asignar individuos a sus poblaciones según sean de origen Atlántico o de origen Mediterráneo en la que los anticuerpos se unen específicamente a los péptidos cuyas secuencias de aminoácidos son SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

2. Combinación de anticuerpos según la reivindicación 1 en la que las secuencias de aminoácidos de los péptidos incluyen una cisteína en el extremo N terminal y una molécula de hemocianina de lapa (KLH) conjugada mediante unión con maleimida.

3. Método de inmunodetección para asignar individuos de merluza europea (Merluccius merluccius) a sus poblaciones según sean de origen Atlántico o de origen Mediterráneo, que se basa en una técnica seleccionada del grupo que comprende: técnicas inmunoenzimáticas (como la técnica ELlSA) , de inmunofluorescencia (como la técnica de FPIA) , de inmunoblot (como la técnica de Westernblot) y de aglutinación (como la técnica de DAT o FAST) o cualquier otro método basado en la detección de antígenos y que incluye la utilización de una cualquiera de las combinaciones de anticuerpos definidas en las reivindicaciones 1-2 frente a antígenos presentes en el cerebro de los individuos de merluza europea.

4. Kit para asignar individuos de merluza europea (Merluccius merluccius) a sus poblaciones según sean de origen Atlántico o de origen Mediterráneo de acuerdo con el método que se define en la reivindicación 3, que incluye una combinación de anticuerpos según se definen en las reivindicaciones 1-2.