Método de obtención de una nueva cepa de Bifidobacterium bifidum con actividad frente a la infección por Helicobacter pylori.

La presente invención se refiere a un procedimiento de obtenciónde una nueva cepa de la especie Bifidobacterium bifidum que es capaz de inhibir el crecimiento de Helicobacter pylori (H.

pylori)por un mecanismo molecular presente en esta cepa y ausente en otras cepas del mismo género. La utilización de este microorganismopuede aplicarse en los sectores agroalimentario y farmacéutico.

Método de obtención de una nueva cepa de Bifidobacterium bifidum con actividad frente a la infección por Helicobacter pylori

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de una nueva cepa de la especie Bifidobacterium bifidum que es capaz de inhibir el crecimiento de Helicobacter pylori (H. pylori) por un mecanismo molecular presente en esta cepa y ausente en otras cepas del mismo género. La utilización de este microorganismo puede 10 aplicarse en los sectores agroalimentario y farmacéutico.

Estado de la técnica

La primera descripción de la bacteria patógena Helicobacter pylori la dio Giulio Bizzozero1 en 1892 al detectar la 15 presencia de los llamados gérmenes espirales en la mucosa gástrica de perros. Hubo que esperar casi noventa años para que Robin Warren y Barr y Marshall2, 3 lograran en 1983 cultivar por primera vez esta bacteria patógena y relacionaran su presencia con la gastritis y la úlcera péptica, aunque no se ha detectado su presencia en los jugos pancreáticos de pacientes afectados por pancreatitis crónica (Gasbarrini et al., 2000) 4. Dicho descubrimiento fue recibido con escepticismo por la clase médica, pero dos décadas después, Warren y Marshall demostraron de forma 20 concluyente esta relación obteniendo el premio Nobel de medicina en 2005 por sus trabajos (Gisbert et al., 2004) 5. Desde entonces H. pylori se ha convertido en uno de los microorganismos cuyo nombre es reconocido por gran parte de la población. La razón para esta fama se debe a la gran prevalencia de la infección por dicho patógeno. Se considera que el 50 % de la población mundial es portadora de H. pylori. En países desarrollados esta cifra se sitúa entre el 15 y el 40 % de la población pero en países en desarrollo aumenta hasta el 80 %, al llegar a implicar al 80 % 25 de los niños menores de diez años (Taylor y Blazer, 1991) 6.

Desde el punto de vista clínico, H. pylori es importante por tres motivos (Gisbert et al., 2004) 5. Su infección es la causa más frecuente de úlcera péptica, de forma que se estima que el 20 % de los individuos infectados con este patógeno desarrollan una úlcera en algún momento de su vida (Peterson, 19917; Solnick y Tompkins, 19928) . 30 Además, en 1994, la Organización Mundial de la Salud y la Agencia Internacional de Investigación en Cáncer establecieron que existía una evidencia epidemiológica e histológica suficiente para concluir que H. pylori es el principal factor de riesgo para la aparición de cáncer gástrico (Eurogast Study Group, 19939; Chong et al., 199410) . Estudios posteriores han reafirmado esta aseveración hasta el extremo que se sugiere que el incremento de riesgo de cáncer gástrico que implica la infección por H. pylori es equiparable al que conlleva el consumo de tabaco en la 35 neoplasia de pulmón. Finalmente, se considera que H. pylori es responsable de un tipo poco frecuente de linfoma, el denominado linfoma tipo MALT gástrico, al provocar la inflamación crónica del tejido linfoide que da lugar al desarrollo de la enfermedad (Vilella et al., 2003) 11. Por todo ello son muchos los autores que recomiendan eliminar la infección por H. pylori siempre que se detecte (Fox y Wang, 2001) 12.

En la actualidad no existe tratamiento frente a la infección por H. pylori que asegure una tasa de curación completa (Gasbarrini et al., 2000) 4. Por ello se habla de "estrategia terapéutica" para combatir el patógeno. La más usada es la llamada triple terapia que consiste en dar un tratamiento entre 7 y 10 días con amoxicilina, claritromicina e inhibidores de la bomba de protones que tiene una eficacia en el entorno del 70-80 % (Lind et al., 199613; The Helicobacter pylori Study Group, 199714) . Las causas principales de fracaso en el tratamiento son la falta de interés 45 del paciente (hay que tomar muchas pastillas por día y hay efectos secundarios desagradables) , la prescripción inapropiada y la presencia de cepas de H. pylori resistentes a los antibióticos utilizados (Deltenre et al., 1998) 15. Cuando fracasa se hace preciso acudir a un tratamiento denominado "pauta cuádruple" que combina un inhibidor de la bomba de protones, metronidazol, subcitrato de bismuto y tetraciclina durante 7 a 14 días (Graham et al., 1991) 16. Aún así continúa habiendo fracasos, por lo que sería deseable la existencia de nuevas terapias o, sobre todo, de 50 mecanismos preventivos de la infección por H. pylori.

En 1989, Bhatia y colaboradores demostraron en experimentos con cocultivos que un aislado comercial de Lactobacillus acidophilus era capaz de competir e inhibir el crecimiento in vitro de H. pylori (Bhatia et al., 1989) 17. Posteriormente se han podido comprobar inhibiciones similares, si bien utilizando sobrenadantes de cultivo libres de 55 células de una cepa concreta que se añadían a un cultivo de H. pylori. Esta aproximación ha sido exitosa con Lactobacillus acidophilus (Mrda et al. 199818, Gasbarrini et al. 200419) , en concreto con las cepas denominadas CRL639 (Lorca et al., 2001) 20, LB (Coconnier et al., 1998) 21, La1 (Michetti et al., 1999) 22 y Shirota (Sgouras et al., 2004) 23, y también con Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Mrda et al. 1998) 18 y con mezclas de las cepas L. acidophilus R0052 y Lactobacillus rhamnosus R0011 (Johnson-Henr y et al., 2004) 24. En todos los casos existe una 60 especificidad de cepa muy considerable (Hamilton-Miller, 2003) 25. También se ha detectado actividad inhibidora del crecimiento de H. pylori con sobrenadantes libres de células de Bacillus subtilis (Pinchuk et al., 2001) 26 y Weissella confusa (Nam et al., 2002) 27, y con el de varias bacterias propias de la cavidad oral como Fuseobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Prevotella oris, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus salivarus y Streptococcus sobrinus (Ishihara et al., 1997) 28. Este último resultado podría explicar la falta de eficacia de H. pylori en la colonización de la cavidad oral.

Parecen existir varios motivos por los que bien estas bacterias, bien un metabolito secretado por las mismas al medio de cultivo, inhiben el crecimiento de H. pylori. Dado que muchas de las cepas seleccionadas son bacterias del ácido láctico se ha sugerido el posible efecto bactericida del ácido láctico o de algún otro ácido orgánico sobre H. 5 pylori (Bathia et al., 198917; Aiba et al., 199829; Hamilton-Miller, 200325) . Sin embargo, en la mayoría de los casos se ha especificada que el efecto lítico se debe a un metabolito secretado al medio de cultivo distinto del ácido láctico, sugiriéndose en ocasiones la existencia de antibióticos (Pinchuk et al., 2001) 26, autolisinas (Lorca et al., 2001) 20 o bacteriocinas (Nam et al., 2002) 27.

En experimentación con cultivos celulares in vitro, se ha podido comprobar la competencia por la unión a células de epitelio gástrico murino o células de carcinoma gástrico humano entre H. pylori y L. acidophilus, L. brevis o L. salivarus cepa WB1004 (Kabir et al., 1997) 30. Como consecuencia, mediante el empleo de estas cepas de bacterias del ácido láctico se reduce la secreción de interleuquina-8 (Kabir et al., 1997) 30. Se ha demostrado un efecto similar de reducción en la producción de interleuquina-8 usando la cepa Lactobacillus gasseri OLL2716 (Ushiyama et al., 15 2003) 31. Incluso se ha sugerido que la competencia por receptores glicolipídicos entre H. pylori y Lactobacillus reuteri podría ser una estrategia a partir de la cual usar esta última bacteria como probiótico eficaz contra H. pylori (Mukai et al., 2002) 32.

Todos estos resultados in vitro han sido refrendados con experimentación preclínica in vivo con modelos animales, 20 sobre todo usando ratones libres de gérmenes (GF por las siglas en inglés de "germ-free") o ratones libres de patógeno específico (SPF por las siglas en inglés de "specific pathogen free") . Kabir y colaboradores demostraron en 1997 que al alimentar ratones GM con la cepa L. salivarus WB1004 estos quedaban protegidos frente a una infección posterior por H. pylori (Kabir et al., 1997) 30. Al hacer el experimento contrario, es decir, producir primero la infección por H. pylori y posteriormente alimentar los ratones con la cepa L. salivarus WB1004, los conteos del 25 patógeno bajaban hasta el 1 % en comparación con los animales no alimentados con la bacteria del ácido láctico (Kabir et al., 1997) 30. Estos experimentos han sido repetidos en otros laboratorios (Aiba et al., 1998) 29. También se dispone de resultados similares usando frente a H. pylori la cepa L. gasseri OLL2716 (Ushiyama et al., 2003) 31 y utilizando una mezcla de las cepas prebióticas L. acidophilus R0052 y Lactobacillus rhamnosus R0011 (Johnson-Henr... [Seguir leyendo]

1. Cepa de Bifidobacterium bifidum depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo de Microorganismos (CECT) con el número de acceso CECT 7366, con actividad para inhibir Helicobacter pylori, y que tenga la capacidad de producir seis péptidos caracterizados por que su secuencia de aminoácidos sea SEC ID Nº: 1 a 6, o un 5 derivado de dichos péptidos.

2. Cepa de Bifidobacterium bifidum de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que las bacterias están presentes como células viables.

3. Cepa bacteriana de Bifidobacterium bifidum de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que las bacterias están presentes como células no-viables.

4. Cultivo bacteriano caracterizado por que se ha obtenido a partir de la cepa bacteriana CECT 7366 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3. 15

5. Cultivo bacteriano, caracterizado por que comprende células viables de la cepa bacteriana CECT 7366, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2.

6. Cultivo bacteriano, caracterizado por que comprende células no viables de la cepa bacteriana CECT 7366, de 20 acuerdo con las reivindicaciones 1 y 3.

7. Sobrenadante de cultivo de la cepa bacteriana CECT 7366 de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, obtenido por fermentación, que tiene actividad anti H. pylori.

8. Utilización de la cepa de Bifidobacterium bifidum de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 para la obtención de los péptidos SEC ID Nº: 1 a 6.

9. Liofilizado, caracterizado por que se ha obtenido de la cepa bacteriana CECT 7366 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 30

10. Liofilizado de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que contiene de 105 - 1011 ufc/g de células de cepa bacteriana CECT 7366, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 3.

11. Utilización de la cepa de Bifidobacterium bifidum CECT 7366 de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, para la 35 preparación de una composición nutritiva y/o farmacéutica, caracterizada por que dicha bacteria y los péptidos SEC ID Nº: 1-6 están presentes en una cantidad que sea suficiente para ejercer un efecto probiótico en dicha composición nutritiva y/o farmacéutica que un individuo necesite, preferiblemente contra Helicobacter pylori.

12. Composición nutritiva, que comprende una cantidad efectiva de la cepa Bifidobacterium bifidum CECT 7366 de 40 acuerdo con las reivindicaciones 1-3 y los péptidos con aminoácidos SEC ID Nº: 1 a 6, junto con cantidades apropiadas de otros alimentos.

13. Composición nutritiva de acuerdo con la reivindicación 12, en la que los otros alimentos se seleccionan del grupo que comprende helados, cereales, zumos, barritas de nutrición, productos lácteos como leche entera, leche 45 desnatada, leche fermentada, leche en polvo, queso, yogures u otros derivados lácteos.

14. Composición nutritiva de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada por que es un yogur.

15. Composición de yogur de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada por que las células de la cepa 50 Bifidobacterium bifidum CECT 7366 de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 tienen una viabilidad de al menos un 80 % durante un periodo de 15 días cuando se mantiene a 5 ºC.

16. Composición nutritiva de acuerdo con las reivindicaciones 12-15, caracterizada por que la cepa Bifidobacterium bifidum CECT 7366 de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 está presente en una cantidad entr.

10. 1011 ufc/g de 55 la composición.

17. Cepa de Bifidobacterium bifidum CECT 7366 de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, para utilización para prevenir o curar úlceras gástricas o el cáncer estomacal producido por infección de Helicobacter pylori.

18. Composición farmacéutica que comprende un liofilizado de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 10 en una cantidad fisiológicamente efectiva junto con los vehículos y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables necesarios para prevenir o curar úlceras gástricas o el cáncer estomacal producido por infección de Helicobacter pylori.

19. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizada por que dicha composición está en forma sólida, como por ejemplo, píldoras, comprimidos, etc; en forma líquida, en suspensión o dispersión.

20. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicaciones 18-19, caracterizada por que además comprende antibióticos para tratar la úlcera gástrica. 5

21. Composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 18-20, caracterizada por que la cepa está presente en una cantidad entr.

10. 1011 ufc/g.