Método de medición del tono vascular ex vivo y cámara de flujo.

Método de medición del tono vascular ex vivo y cámara de flujo.

La presente invención se refiere a un método de medición del tono vascular ex vivo que comprende: perfundir un flujo constante de una suspensión celular en un circuito abierto que incluye un vaso cuyo tono se desea estudiar, cerrar el circuito, perfundir una solución nutricia de Krebs en el circuito cerrado y aplicar una presión transmural constante, añadir una sustancia vasoactiva y registrar las variaciones de diámetro del vaso mediante un sistema de captación de imágenes situado perpendicularmente al vaso y acoplado a un microscopio.

La invención también se refiere a una cámara de flujo en la que realizar el método de medición del tono vascular que incluye dos capilares de vidrio, un baño, una bomba de infusión, un sistema de presión hidrostática, un manómetro, un sistema de termorregulación de la temperatura del baño y de las soluciones y/o suspensiones utilizadas, un sistema de captación de imágenes y un microscopio.

Método de medición del tono vascular ex vivo y cámara de flujo.

Sector de la técnica

La presente invención se relaciona con la medición del tono vascular mediante contracción de un segmento vascular. Utiliza una medición del diámetro externo del vaso antes del paso de una suspensión celular por el mismo. La presurización se realiza por presión hidrostática. El dispositivo permite relacionar la adhesión y flujo celular con la vasodilatación y vasoconstricción.

Antecedentes de la invención

El tono vascular determina la vasodilatación o vasoconstricción en respuesta a diferentes estímulos. En las enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión arterial, se produce una disfunción de los mecanismos reguladores del vaso que produce un aumento basal del tono vascular, y una respuesta incrementada a sustancias vasoconstrictoras, perdiendo el vaso la capacidad de relajarse en respuesta a sustancias normalmente vasodilatadoras como el óxido nítrico (NO).

De forma específica, se ha demostrado que la disfunción endotelial está relacionada con un aumento del tono vascular. Curiosamente, la mayoría de los factores de riesgo cardiovascular se han demostrado lesivos para el endotelio humano. Este daño endotelial podría suponer la pérdida de la capacidad de formación de sustancias vasodilatadoras derivadas de endotelio como el NO, así como la capacidad de respuesta a las sustancias que estimulan al endotelio, la síntesis y liberación del NO, como es la acetilcolina.

En diversos estudios se ha relacionado la buena función endotelial con la conservación de una adecuada capacidad vasodilatadora, lo que supone una buena regulación del tono vascular. El tono vascular puede medirse ex vivo con muestras de vasos sanguíneos, y los dispositivos que se utilizan para realizar esta medición han supuesto una poderosa herramienta en la investigación de fármacos/mediadores, mecanismos reguladores del tono vascular en la fisiología y farmacología experimental.

Existen distintos modelos experimentales que permiten estudiar el efecto de sustancias biológicas en los vasos. El más utilizado es el baño de órganos y anillos vasculares. En este dispositivo, conocido y utilizado desde hace décadas, existe una copa con líquido nutricio a 37°C y perfundido con gas carbógeno (95% O2 + 5% CO2), en el que se montan anillos vasculares en dos alambres, dando una tensión transmural fija, y observando los cambios en la misma tras la adición en la copa de sustancias vasodilatadoras o vasoconstrictoras (Furchgott et al., Nature 1980; 288:373-376). Aunque este procedimiento permite medir contracciones isométricas con cambios en la fuerza pero no en el diámetro, supone una tensión no fisiológica, y el corte de los anillos vasculares puede alterar la geometría existente en el vaso in vivo.

Para mejorar ese dispositivo, se desarrolló un miógrafo por Mulvanny et al., Circ. Res. 1977; 41:19-26. En este dispositivo, se monta un segmento vascular más largo, y además de la tensión transmural se mide la circunferencia interna del vaso mediante un microscopio, aplicando una presión transmural fija. Este aparato permite medir la relación

entre tensión transmural, diámetro interno y diámetro externo en diferentes lechos vasculares.

Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el tono vascular se regula in vivo en condiciones de flujo. Y al mismo tiempo, más que la propia tensión transmural isométrica, el factor más importante para la regulación del tono vascular in vivo es el diámetro interno del vaso. Por ello, en el dispositivo descrito en Henrion et al., J Clin Invest 1997; 100: 2909-2914, el tono vascular se mide mediante un sistema abierto de flujo. La presión transmural necesaria para que el vaso se dilate o contraiga, y con ello haya registro, se consigue con un servocontrol de presión de entrada y salida. Este sistema está recogido en los miógrafos modelos 110P y 111P, comercializados por la casa Danish Myotechnology (DMT).

Los sistemas existentes en la actualidad: baño de órganos (Furchgott), miógrafo de presión (Mulvanny) cerrados y abiertos y con servocontrol de presión (DMT) presentan limitaciones. La tensión conseguida en el sistema de anillos es suprafisiológica.

Las limitaciones de los miógrafos descritos pueden ser paliadas con la aplicación de un sistema isovolumétrico, como el descrito en la solicitud de patente W02006/119143. Este sistema se basa en un sistema cerrado en el que se aplica un volumen constante de una solución dentro del vaso, en condiciones estáticas. En esta solución, se diluye una sustancia vasoactiva, y se permite registrar tanto la diferencia de presión como el diámetro del vaso. Este sistema patentado presenta además la ventaja de que, al aplicarse la sustancia vasoactiva por dentro del vaso, pueden utilizarse moléculas de alto peso molecular que no atraviesen el endotelio. Sin embargo, presenta la limitación, ya comentada, de no poder valorar el efecto de una perfusión en flujo, que es como tiene lugar la regulación del tono vascular en condiciones fisiológicas.

De hecho, en los últimos tiempos se ha descrito la existencia de células provenientes de la médula ósea, denominadas células progenitoras endoteliales (EPCs), que se adhieren al vaso dañado y permiten regenerar la función endotelial del mismo. Se ha relacionado el tropismo de estas células (formación de colonias, adhesión, proliferación), con la vasorrelajación dependiente de endotelio en pacientes humanos (Hill et al., N Engl J Med 2003 Feb 13; 348:593-600).

Dada la importancia de la adhesión de las EPCs en el mantenimiento del tono vascular, se han desarrollado dispositivos para la medición del tono vascular en condiciones de bajo flujo, lo que permite la adhesión de elementos celulares reguladores del tono vascular como se describirá más abajo, similares a las que se producen in vivo en los vasos pequeños. Un ejemplo es la cámara de flujo patentada por Weber (DE 1 0328277). En este dispositivo se pasa una suspensión de células progenitoras endoteliales en cultivo y resuspendidas a 350.000/ml en medio HBSS suplementado con Ca2+ (1 mM) y Mg2+ (1 mM) a un flujo laminar de 0,1 ml/min, midiéndose la adhesión sobre una placa de cultivo sobre la que se ha añadido previamente una matriz de fibronectina, colágeno, o una monocapa de cultivo de células endoteliales o de cualquier otro linaje. En un experimento típico la adhesión se mide contando el número de células adheridas a los 5 minutos, usando una videocámara acoplada a un microscopio.

Otro ejemplo es la cámara de los hermanos Badimón, descrita en Ruiz et al., Front Biosci. 2009; 14:3608-3618, que mimetiza la forma cilindrica de los vasos sanguíneos y se basa en una cámara de flujo, sobre la que se coloca una arteria abierta longitudinalmente. La

suspensión celular (células resuspendidas en medio HHMC - HEPES-buffered HBSS, 1 mM Mg2+/Ca2+, 0,5% BSA -) a 37°C pasa sobre dicha arteria a un flujo laminar de 0,3 ml/min y la adhesión se cuantifica a posteriori mediante inmunohistoquímica a diversos tiempos.

Dados estos antecedentes, el objetivo de la presente invención es desarrollar un sistema que permita medir la adhesión en flujo de células en suspensión sobre un vaso, y el efecto de las mismas en la reactividad vascular.

Descripción de la invención

Método de medición del tono vascular ex vivo y cámara de flujo.

La presente invención se refiere a un método para la medición del tono vascular ex vivo que incluye:

a) perfundir con un flujo constante, es decir, sin aplicar presión externa, una suspensión celular en un circuito abierto que comprende el vaso sanguíneo cuyo tono se desea estudiar;

b) cambiar el circuito abierto del paso a) a circuito cerrado;

c) perfundir una solución nutrida de Krebs por el vaso en el circuito cerrado del paso b) al que se aplica una presión transmural;

d) añadir a la solución nutricia una sustancia vasoactiva o un fármaco objeto de estudio;

e) registrar las variaciones de diámetro del vaso mediante un sistema de captación de imágenes situado perpendicularmente al vaso.

A continuación, el vaso puede fijarse y utilizarse para diversas aplicaciones como, por ejemplo, técnicas de inmunohistoquímica con mareajes específicos y/o de microscopía electrónica.

El flujo del paso a) es entre 0,1 y 0,3 ml/min. La suspensión de células puede contener entre 10 y 1010 células/mi diluidas en un medio tamponado. Las células pueden seleccionarse entre: células progenitoras endoteliales, leucocitos, plaquetas, hematíes y/o células cuyo efecto sobre el tono vascular se desee evaluar. Por otro lado, como medio tamponado puede utilizarse un medio suplementado...

1. Método para la medición del tono vascular ex vivo que incluye:

a) perfundir un flujo constante de una suspensión celular en un circuito abierto que comprende el vaso cuyo tono se desea estudiar;

b) cambiar el circuito abierto (paso a) a circuito cerrado;

c) perfundir una solución nutricia de Krebs en el circuito cerrado y aplicar una presión transmural constante;

d) añadir la sustancia vasoactiva bajo estudio

e) registrar las variaciones de diámetro del vaso mediante un sistema de captación de imágenes situado perpendicularmente al vaso y acoplado a un microscopio.

2. Método según la reivindicación 1 en el que la suspensión celular contiene células seleccionadas del siguiente grupo: células progenitoras endoteliales, leucocitos, plaquetas, hematíes y/o células cuyo efecto sobre el tono vascular se desee evaluar.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en el que la suspensión celular contiene entre 10 y 1010 células/mi de medio.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que la presión transmural constante del paso c) es de 40 mmHg para vasos con diámetro menor a 1200 pm y de 60 mmHg para vasos con un diámetro igual o superior a 1200 pm.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en el que la sustancia vasoactiva del paso d) es noradrenalina o acetilcolina.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en el que el sistema de captación de imágenes del paso e) comprende una cámara fotográfica de alta tasa de disparo.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en el que se añade un paso f) que incluye la fijación del vaso y una técnica inmunohistoquímica y/o de microscopía electrónica.

8. Kit que comprende células seleccionadas del grupo de las células progenitoras endoteliales, leucocitos, plaquetas y/o hematíes así como las soluciones tamponadas, los iones, las sustancias vasoactivas y los elementos necesarios para medir el tono vascular ex vivo según se define en el método de las reivindicaciones 1-7.

9. Cámara de flujo en vaso ex vivo para la medición del tono vascular que incluye:

dos capilares de vidrio separados por una distancia de entre 1 y 50 mm para insertar entre ellos un segmento de vaso sanguíneo ex vivo de entre 200 y 2000 pm de diámetro externo y entre 2 y 70 mm de longitud;

un baño de órganos;

una bomba de infusión;

un sistema de presión hidrostática que comprende dos columnas con un tubo cada una de ellas y un tornillo de elevación de cada tubo con el que modificar la presión

entre 10 y 100 mmHg;

un manómetro;

un sistema de termorregulación de la temperatura del baño de órganos y de los

medios perfundidos en el vaso sanguíneo;

un sistema de captación de imágenes;

un microscopio.

10. Cámara de flujo según la reivindicación 9 en la que el sistema de captación de imágenes comprende una cámara fotográfica de alta tasa de disparo.