Método de análisis biológico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición.

Un kit para el diagnóstico de enfermedades de la tiroides, que comprende una célula que expresa un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides (TSHR),

un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, en donde la proteína sensible al calcio es una proteína que emite luminiscencia en respuesta al calcio.

Método de análisis biológico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición

Campo técnico

La presente invención se refiere a un kit que comprende una célula que expresa un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides (TSHR), un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, y a métodos para el diagnóstico de la enfermedad de la tiroides y para el diagnóstico de hipotiroidismos utilizando la célula.

Técnica anterior

Una hormona estimuladora de la tiroides (TSH) producida por la glándula pituitaria se une a un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides (TSHR) presente en la glándula tiroides para promover la secreción de una hormona tiroidea. Puesto que la hormona tiroidea es una hormona que potencia el metabolismo sistémico, el aumento anormal o la disminución anormal de la acción de esta hormona afecta de diversas maneras a la mente y al cuerpo, causando la enfermedad de la tiroides. Por ejemplo, en relación con la enfermedad de Graves, un anticuerpo estimulador de la tiroides (TSAb) se produce en el cuerpo, y este anticuerpo, en lugar de TSH, estimula excesivamente el TSHR de manera que las funciones de la glándula tiroides se incrementan y aparecen síntomas tales como agrandamiento de la glándula tiroides, exoftalmos y taquicardia. Por otro lado, entre los hipotiroidismos, hay algunas enfermedades en las que se produce un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides (TSBAb) de manera que las funciones de la glándula tiroides se reducen y aparecen síntomas tales como un aumento de peso, depresión y fatiga general.

Hasta ahora, el análisis de estos autoanticuerpos (TSAb y TSBAb) contenidos en la sangre se ha utilizado para el diagnóstico de la enfermedad de Graves y el hipotiroidismo.

Los ejemplos representativos de un método de medición de los autoanticuerpos han sido referidos como sigue:

un método de análisis de radiorreceptores (método TBII) que utiliza una TSH marcada con radioisótopo o un anticuerpo monoclonal contra TSHR, en el que dicha TSH marcada con radioisótopo o dicho anticuerpo monoclonal contra TSHR inhibe competitivamente la unión del autoanticuerpo en el suero de un paciente a TSHR de modo que se puede medir una cantidad de autoanticuerpo unido; y

un método de análisis biológico (método TSAb) para medir una cantidad de TSAb, en el que células de la glándula tiroides porcina son tratadas con un anticuerpo que se une a TSHR y la cantidad de TSAb se determina midiendo un aumento en la concentración de AMPc en las células de la glándula tiroides utilizando AMPc marcado con radioisótopo (Biobliografías no de Patente 1 y 2).

El documento WO 29/45292 describe un análisis para autoanticuerpos del receptor de TSH basado en células transfectadas con TSHR (es decir células CHO). Estos análisis utilizan niveles de luciferasa inducida por AMPc como criterio de valoración.

Literatura no de patente 1: Methods in Enzymology, 74, 45-42 (1981)

Literatura no de patente 2: J Clin Endocrinol Metab. Mayo de 1986; 62 (5): 855-62

Compendio de la invención

Problema técnico a resolver

Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición para la medición de TSAb y/o TSBAb y una composición para el diagnóstico de una enfermedad de la tiroides, que puede ser manipulada más convenientemente que los métodos convencionales sin el uso de un radioisótopo que requiere técnicas o equipos especiales. Además, un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para el diagnóstico de una enfermedad de la tiroides utilizando la composición.

Solución al Problema

El autor de la presente invención utiliza una proteína sensible al calcio para medir la cantidad de entrada de iones de calcio en una célula estimulada por AMPc que se forma por la unión de un anticuerpo estimulador de la tiroides (TSAb) a un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides (TSHR). Como resultado, el autor de la presente invención ha medido correctamente la cantidad de TSAb sin utilizar un radioisótopo. Además, el autor de la presente invención también ha medido correctamente la cantidad de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides (TSBAb) utilizando principios similares, y, en consecuencia completado la presente invención.

Específicamente, la presente invención se refiere a un kit para el diagnóstico de una enfermedad de la tiroides, que comprende una célula que expresa un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides (TSHR), un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, en donde la proteína sensible al calcio es una proteína que emite luminiscencia en la respuesta al calcio. Además, la presente Invención se refiere a un método para el diagnóstico de enfermedad de la tiroides que comprende las siguientes etapas (1), (2) y (3) o (1'), (2) y (3):

(1) preparar una mezcla que contiene una célula comprendida en el kit como se definió anteriormente, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio exento de Ca2+ o un medio exento de Ca2+/Mg2+, TSH y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo; o (1') preparar una mezcla que contiene una célula comprendida en el kit como se definió anteriormente, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio exento de Ca2+ o un medio exento de Ca2+/Mg2+ y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo;

(2) añadir una disolución que contiene Ca2+ a la mezcla preparada en (1) o (1'); y

(3) medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida desde la célula.

Además, la presente invención también se refiere a un método para el diagnóstico del hipotiroidismo, que comprende las siguientes etapas (1) a (3):

(1) preparar una mezcla que contiene una célula comprendida en el kit como se definió anteriormente, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio que contiene Ca2+, TSH y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo;

(2) añadir una disolución que contiene forskolina a la mezcla preparada en (1); y

(3) medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida desde la célula.

Efectos ventajosos de la invención

La presente invención elimina la necesidad de procedimientos complicados acompañados del uso de radioisótopos. Por lo tanto, la medición de la cantidad de un anticuerpo estimulador de la tiroides (TSAb) y la cantidad de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides (TSBAb) contenido en una muestra biológica y el diagnóstico de una enfermedad de la tiroides se puede lograr mediante procedimientos sencillos y seguros.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La Figura 1 muestra que la luminiscencia emitida desde las células CHO que expresan TSHR humano, el canal CNG modificado y aequorina modificada depende de una concentración de TSH bovina

(bTSH).

[Figura 2] La Figura 2 muestra una cantidad de luminiscencia emitida desde las células CHO que expresan TSHR humano, el canal CNG modificado y aequorina modificada, en presencia de una dosis baja de bTSH. [Figura 3] La Figura 3 muestra los efectos de una concentración de un sustrato luminiscente para la aequorina y el tiempo de incubación en una cantidad de luminiscencia emitida desde las células CHO que expresan TSHR humano, el canal CNG modificado y aequorina modificada.

[Figura 4] La Figura 4 muestra los efectos de una cantidad de plásmido de expresión de TSHR introducido sobre la cantidad de luminiscencia emitida desde las células CHO que expresan TSHR humano, el canal CNG modificado y aequorina modificada.

[Figura 5] La Figura 5 muestra una relación entre una concentración de células CHO que expresan TSHR humano, el canal CNG modificado y aequorina modificada, y la cantidad de luminiscencia de las células. [Figura 6] La Figura 6 muestra la relación entre la concentración de células CHO que expresan TSHR humano, el canal CNG modificado y aequorina modificada, y la cantidad de luminiscencia de las células, donde se indica la cantidad de luminiscencia como un valor relativo que se calcula en el supuesto de que el valor relativo para cada blanco es 1.

[Figura 7] La Figura 7 muestra los efectos de una concentración de CaCI2 añadido sobre la cantidad de luminiscencia emitida desde las células CHO que expresan TSHR humano, el canal CNG modificado y aequorina modificada.

[Figura 8] La Figura 8 muestra que un kit de acuerdo con la presente invención... [Seguir leyendo]

1. Un kit para el diagnóstico de enfermedades de la tiroides, que comprende una célula que expresa un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides (TSHR), un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, en donde la proteína sensible al calcio es una proteína que emite luminiscencia en respuesta al calcio.

2. El kit de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un anticuerpo anti-TSH.

3. El kit de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende adicionalmente ViviRen (R) como sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio.

4. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende adicionalmente TSH o un anticuerpo monoclonal TSAb estimulador.

5. El kit según la reivindicación 4, que comprende adicionalmente forskolina.

6. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el TSHR es TSHR que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, el canal de calcio dependiente de AMPc es un canal de calcio CNG modificado que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 y la proteína sensible al calcio es apoaequorina modificada que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 3.

7. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula CHO, una célula HEK293 y una célula 3T3.

8. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para se uso en el diagnóstico de enfermedades de la tiroides.

9. El kit de la reivindicación 8, en donde se determina la cantidad de un anticuerpo estimulador de la tiroides y/o la cantidad de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides en una muestra biológica.

1. El kit según la reivindicación 8 o 9, para el diagnóstico de la enfermedad de Graves y/o la enfermedad de Hashimoto.

11. Un método para el diagnóstico de enfermedades de la tiroides, para determinar que un ser humano tiene un alto riesgo de desarrollar una enfermedad de la tiroides, o para determinar la eficacia del tratamiento de la enfermedad de la tiroides, que comprende las siguientes etapas (1), (2) y (3) o (T), (2) y (3):

(1) preparar una mezcla que contiene la célula comprendida en el kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio exento de Ca2+ o un medio exento de Ca 2+/Mg2+, TSH y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo; o

(T) preparar una mezcla que contiene la célula comprendida en el kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio exento de Ca2+ o un medio exento de Ca 2+/Mg2+ y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo;

(2) añadir una disolución que contiene Ca2+ a la mezcla preparada en (1) o (T); y

(3) medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida desde la célula.

12. El método según la reivindicación 11, en donde la mezcla preparada en (11) contiene adicionalmente un anticuerpo anti-TSH.

13. Un método para el diagnóstico del hlpotlroidismo, que comprende las siguientes etapas (1) a (3):

(1) preparar una mezcla que contiene la célula comprendida en el kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio que contiene Ca2+, TSH o un anticuerpo monoclonal TSAb estimulador y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo;

(2) añadir forskolina a la mezcla preparada en (1); y

(3) cuantificar la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida desde la célula.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde la célula no se cultiva en un ambiente estéril.

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en donde el TSHR es TSHR que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 1, el canal de calcio dependiente de AMPc es un canal de calcio CNG modificado que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, la proteína sensible al calcio es apoaequorina modificada que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 3 y el sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio es ViviRen (R).