Medio de cultivo celular mejorado.

Un medio de cultivo celular libre de suero para el crecimiento de células de mamífero,

caracterizado porque tiene una relación molar de iones sodio con respecto a potasio, de entre 10 a 1 y 1 a 1.

Medio de cultivo celular mejorado Campo técnico de la invención

La presente invención se relaciona con el campo general de la biotecnología, particularmente el cultivo de células y su uso para la producción de polipéptidos a escala industrial.

La presente invención proporciona medios de cultivo celular que son adecuados para el cultivo de células con una alta viabilidad celular, preferiblemente células de mamífero tales como células CHO, y que se caracterizan por su relación molar de iones sodio con respecto a los de potasio. Los medios de cultivo celular de conformidad con la presente invención, permiten obtener altas productividades de polipéptidos, cuando se utilizan para la producción de un polipéptido, en particular mediante la expresión recombinante de polipéptidos en sistemas de cultivo de células de mamífero, en particular a escala industrial.

Antecedentes técnicos de la Invención

La preparación de polipéptidos utilizando la tecnología recombinante, ha desarrollado un procedimiento normalizado durante las últimas dos décadas. El acceso a polipéptidos recombinantes mediante la clonación de genes que codifican para el respectivo polipéptido, seguido por una transformación posterior de huéspedes de expresión adecuados con el gen por ser expresado y la producción final y purificación del producto polipeptídico recombinante obtenido, ha proporcionado acceso a toda una nueva clase de agentes terapéuticos biológicamente diseñados y producidos.

La industria farmacéutica prepara cada vez más compuestos farmacéuticamente activos utilizando la tecnología de ADN recombinante, seguida por procesos de producción desarrollados en el campo de la bioingeniería.

Tales productos biológicos incluyen anticuerpos monoclonales, que se han desarrollado como opciones importantes de tratamiento en varios campos médicos, incluyendo enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios, inmunosupresión, oncología y similares.

El desarrollo de tales agentes terapéuticos de origen biológico, requiere una producción a escala industrial, proporcionando de esta manera acceso a grandes cantidades del polipéptido recombinante. Los sistemas de expresión preferidos son cultivos de células de mamífero, que son superiores a la mayoría de los demás sistemas eucarióticos basados en células de insecto, de levadura o similares, o incluso los tradicionales sistemas de expresión en procariotes.

Sin embargo, el cultivo de células de mamífero incluye grandes desafíos, especialmente a escala industrial. Las instalaciones de producción para los cultivos de células de mamífero requieren una completa optimización de numerosas condiciones del proceso.

Uno de los parámetros de proceso más importantes para controlar el proceso de producción general, es el medio en el cual se cultivan las células y tiene lugar la producción el polipéptido. Los medios de cultivo celular adecuados deben proporcionan cultivos celulares con todos los nutrientes necesarios, lo cual es especialmente difícil si no se agregan a los medios componentes de origen animal, tales como suero o proteínas, por ejemplo factores de crecimiento.

En consecuencia, se han desarrollado una gran variedad de diferentes medios de cultivo celular. En algunos casos, el foco ha estado en la composición general y se han propuesto medios con una amplia variedad de diferentes sustancias (Patente Norteamericana US 5 122 469; Patentes Europeas EP 481 791, EP 283 942). En otros casos, se han sugerido ingredientes particulares para mejorar el cultivo celular. Las principales metas han sido mejorar ya sea el crecimiento, o la supervivencia de las células, o la cantidad y calidad de los polipéptidos expresados de manera recombinante.

Los aspectos específicos abordados en los documentos de la técnica anterior, entre otros, se encuentran la contribución de iones traza particulares (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO 2/6663; Patentes Europeas EP 872 487, EP 1 36 314 A2), vitaminas tales como el ácido ascórbico (e.g. Patente Norteamericana US 6 838 284), carbohidratos (Patente Europea EP 1 543 16) o el contenido de aminoácidos específicos, en combinación con características adicionales (por ejemplo, Patente Europea EP 51 435; Patentes Norteamericanas US 5 83 761, US 7 294 484).

Los principales iones y sus concentraciones en los medios de cultivo celular, se mantienen constantes en gran

medida y permanecen sin consideración ni alteración. Todos los tipos clásicos de medios, tales como el DMEM, DMEM/F12 BME o RPMI 164, utilizan rangos relativamente estrechos y fijos para las concentraciones de los iones en general, y de los cationes monovalentes Na+ y K+, en particular. Esto concuerda con el hecho de que el balance iónicos del grueso de los iones en general, y de los cationes monovalentes Na+ y K+ en particular, sea más bien una propiedades universal de la mayoría de las células de mamífero.

Más detalladamente, el gradiente transmembranal de iones sodio y potasio, es una propiedad básica de las células de mamífero con alta concentración de iones potasio en el interior de la célula y alta concentración de iones sodio fuera de la célula. La bomba de sodio y potasio es una de las principales bombas iónicas de la membrana celular, la cual es electrogénica y contribuye a establecer y mantener el respectivo gradiente de iones sodio y potasio a través de la membrana (Kaplan, Membrane catión transport and the control of proliferation of mammalian cells. Annu Rev Physiol.; 4: 19-41 (1978)). La bomba utiliza aproximadamente 3% de la energía de las células y es uno de los procesos de mayor consumo de energía de las mismas. Numerosos procesos bioquímicos básicos están acoplados con el gradiente electroquímico de iones sodio, tal como por ejemplo el intercambio Na+/Ca+ o el transporte de aminoácidos al interior de las células. Las concentraciones de iones sodio y potasio fuera de una célula, por lo tanto, son parámetros de primordial importancia que tienen influencia sobre el gradiente de estos iones a lo largo de la membrana y el estado básico de las células.

De conformidad con la concentración típica de iones sodio en el interior y exterior de una célula de mamífero genérica (Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (1994)), casi siempre se escogen concentraciones de sodio de aproximadamente 145 mM, junto con concentraciones del ión potasio de alrededor de 5 mM. Para la mayoría de los tipos de medios de cultivo, esto da como resultado una relación entre los iones de sodio y potasio, que varía dentro del rango de aproximadamente 2-3 (véase la Tabla 1 más adelante, y por ejemplo la Patente Norteamericana US 5 135 866).

Sólo unos pocos documentos de la técnica anterior describen medios de cultivo celular adecuados para el cultivo de células de mamífero o la producción de proteínas recombinantes, que mencionen relaciones específicas de iones sodio y potasio. Estos documentos sugieren composiciones de medios con relaciones específicamente altas, en el alto rango de aproximadamente 3,7 en la Patente Norteamericana US 5.232.848, o en un rango de entre aproximadamente 25 y 35, alcanzando de esta manera incluso valores más altos (Patentes Europeas EP 283 942; EP 389 786). Otros medios tales como el HAM-F12 o medios de cultivo de células de animales definidos, tales como los propuestos en la Solicitud de Patente Norteamericana US 28/261259, también sugieren específicamente valores más altos (por ejemplo, de 27,9 a 57,5 en la Solicitud de Patente Norteamericana US 28/261259). Sólo muy pocos documentos describen medios de cultivo que tengan una relación de iones sodio con respecto a potasio, menor de 2, por ejemplo de 11,5-3 (Patente Norteamericana US 7.294.484); o una relación de aproximadamente 15 (Patente Norteamericana US 6.18.41). Estos documentos todavía utilizan relaciones mayores de 1 y tampoco asignan una ventaja particular al cambio de este parámetro, a los valores como los aquí mencionados.

Además de los efectos relacionados con el balance iónico entre iones particulares, también la contribución de los principales iones a la osmolaridad general del medio, se le debe tomar en cuenta. La mayoría de los medios de cultivo convencionales, tales como por ejemplo el DMEM, MEM alfa o medio de Fischer, están caracterizados por una alta cantidad de cloruro de sodio.

La Publicación de Patente Internacional WO 2/1119, describe el alto contenido de glucosa en el medio, en combinación con el uso de una más alta osmolaridad. La alta concentración de glucosa entre aproximadamente 2- 4 g/l, se ha alcanzado reduciendo o incluso eliminando por completo agentes tales como el cloruro de sodio, manteniendo de esta manera la osmolaridad dentro... [Seguir leyendo]

1. Un medio de cultivo celular libre de suero para el crecimiento de células de mamífero, caracterizado porque tiene una relación molar de iones sodio con respecto a potasio, de entre 1 a 1 y 1 a 1.

2. El medio de cultivo celular de la reivindicación 1, en donde el medio es un medio libre de proteína.

3. El medio de cultivo celular de la reivindicación 1 o 2, en donde la relación molar de iones sodio con respecto a potasio, está entre 8 a 1 y 6 a 1.

4. El medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la concentración de iones sodio está entre 5 y 9 mM.

5. El medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la concentración de iones potasio está entre 8 y 12 mM.

6. El medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la concentración total de aminoácidos está entre 4 y 1 mM.

7. El medio de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la relación molar entre la concentración total de iones y la concentración total de aminoácidos, está entre 1.9 y 4.

8. Un proceso para la producción de un polipéptido recombinante, que comprende cultivar células de mamífero en un medio como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y expresar el polipéptido recombinante.

9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, en donde las condiciones de cultivo comprenden al menos una modificación de temperatura y/o al menos una modificación del pH.

1. El proceso de conformidad con la reivindicación 8 o 9, en donde el cultivo se realiza mediante un proceso por lotes con alimentación.

11. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 1, en donde los polipéptidos producidos están glucosilados.

12. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde el polipéptido es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

13. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde las células de mamífero se seleccionan del grupo que consiste de células CHO, células HEKy células SP2/.

14. Un proceso para la producción de un medio de cultivo celular de conformidad con la reivindicación 1, en donde los diferentes componentes se mezclan unos con otros.

15. El proceso de conformidad con la reivindicación 14, en donde se agrega cloruro de sodio a una concentración entre 7 y 15 mM.

16. El proceso de conformidad con la reivindicación 14 o 15, en donde se agrega cloruro de potasio a una concentración entre 8 y 12 mM.