Lisis mejorada y transcripción reversa para la cuantificación de mRNA.

Método para realizar una RT-PCR para amplificar un RNA diana que comprende los pasos de

a) el cultivo de una población de células adherentes en un recipiente de cultivo de células

b) la lisis de dicha población de células adherentes que se supone que contiene dicho RNA diana en dicho recipiente de muestras con un tampón de lisis que comprende entre 0,

05 M y 1 M de un agente caotrópico

c) la adición de reactivos a dicho recipiente de muestras que son necesarios para realizar una reacción de transcripción inversa de forma que el agente caotrópico está presente en una concentración de aproximadamente de 10 a 60 mM en dicho recipiente de muestras, y la transcripción reversa de dicho RNA diana en la primera hebra de cDNA

d) amplificar dicha primera hebra de cDNA mediante la realización de múltiples ciclos de un protocolo de termociclado.

Lisis mejorada y transcripción reversa para la cuantificación de mRNA Campo técnico

La presente invención proporciona un nuevo método para la monitorización de la expresión génica por medio de la realización de RT-PCR. Más precisamente, la presente invención describe una posibilidad para lisar las células adherentes en el vial en el que se han cultivado y, posteriormente, transcribir de forma reversa el RNA contenido en el lisado en cDNA monocatenario en el mismo vial.

Antecedentes de la técnica

Las células en una población son, en muchos aspectos únicas en sus características, incluso en un cultivo o tejido aparentemente homogéneo. Los niveles de expresión génica muestran grandes variaciones entre células, debido a fuentes de factores externos (extrínsecos) e internos (intrínsecos). Del mismo modo, cuando se expone a estímulos idénticos, las células a menudo se comportan estocásticamente. Esto significa que los datos obtenidos a partir de una población de células no pueden ser asumidas para reflejar el comportamiento de la célula individual. Se ha sugerido que las células pueden responder a los estímulos por ráfagas en la actividad transcripcional y operar como un interruptor binario; es decir de una manera totalmente de todo o nada.

Por lo general, la expresión génica en el nivel de RNA se controla de forma rutinaria mediante un procedimiento de múltiples pasos. En primer lugar, la correspondiente muestra celular se retira del recipiente de cultivo. En el caso de haber células adherentes la recogida se pueden realizar con la ayuda de tripsina (tratamiento con una solución de tripsina-EDTA) con el fin de separar la células adherentes del soporte sólido. En segundo lugar, las células recogidas se sedimentan y se someten a lisis celular. El tercer paso se requiere generalmente para purificar al menos parcialmente el RNA o mRNA que está presente en la muestra (PE 389 63). Después, un paso de síntesis de la primera cadena de cDNA se realiza con una DNA polimerasa dependiente de RNA tal como la transcriptasa inversa AMV (Roche Applied Science N° de Cat.: 11 495 62) o MMuLV (Roche 11 62 63).

Posteriormente, la cantidad de cDNA generado se cuantifica ya sea por medio de PCR cuantitativa (Sagner, G., y Goldstein, C., Biochemica 3 (21) 15-17) o, alternativamente, por medio de la amplificación y posterior hibridación ción en un microarray de DNA (Kawasaki, ES, Ann. NY Acad. Sci. 12 (24) 92-1). En caso de PCR, se puede realizar una RT-PCR de un paso, caracterizado porque la primera síntesis de cDNA y la amplificación posterior son catalizadas por la misma polimerasa tal como la polimerasa T.th (Roche Applied Science N° de Cat. 11 48 14).

En la RT-PCR a tiempo real tradicional o qRT-PCR, el RNA es aislado por primera vez a partir de células en un procedimiento largo que puede conducir a una pérdida de material. Usando el sistema de síntesis de cDNA CelIsDirect (Invitrogen N° de Cat. 11737-3), las células se lisan y el cDNA se genera a partir del lisado en un solo tubo con una manipulación mínima y no hay pérdida de la muestra. Se añade DNasa I para eliminar el DNA genómico antes de la síntesis de la primera cadena. Después de la síntesis, la primera cadena de cDNA se puede transferir directamente a la reacción de qPCR sin extracción orgánica intermedia o precipitación con etanol. Este equipo ha sido optimizado para muestras de células pequeñas, que van desde 1. células hasta una sola célula. Un protocolo similar se describe en (WO 8/135197).

En este contexto, el problema técnico que subyace en la presente invención era proporcionar un método de alto rendimiento que permita un protocolo de análisis de seguimiento de la expresión de genes más simplificado.

Breve descripción

Así, la presente invención está dirigida a un método para realizar una RT-PCR para amplificar un RNA diana que comprende los pasos de

a) el cultivo de una población de células adherentes en un recipiente de cultivo de células

b) la lisis de dicha población de células adherentes que se supone que contiene dicho RNA diana en dicho recipiente de muestras con un tampón de lisis que comprende entre ,5 M y 1 M de un agente caotrópico

c) la adición de reactivos a dicho recipiente de muestras que son necesarios para realizar una reacción de transcripción inversa de forma que el agente caotrópico está presente en una concentración de aproximadamente de 1 a 6 mM en dicho recipiente de muestras, y la transcripción reversa de dicho RNA diana en la primera hebra de cDNA

d) amplificar dicha primera hebra de cDNA por medio de la realización de múltiples ciclos de un protocolo de termociclado.

En una realización importante, el paso de amplificación se monitoriza en tiempo real.

Preferiblemente, el agente caotrópico es tiocianato de guanidina

También preferiblemente, el tampón de lisis comprende entre aproximadamente ,2 y ,5 M del agente caotrópico.

Durante el paso c) del método de la invención, el agente caotrópico está presente en una concentración de aproximadamente 3 a 5 mM y preferiblemente de aproximadamente 4 mM.

También preferiblemente, el paso b) del nuevo método se lleva a cabo en presencia de un detergente no iónico que por ejemplo puede ser NP4. Durante el paso c), dicho detergente no iónico tiene un V / V entre ,1 y 2%.

También preferiblemente, el paso a) comprende la adición de un hidrato de carbono, que puede ser un azúcar o un dextrano.

En una realización particular, se añade una DNAsa entre los pasos b) y c), o durante el paso c. Preferiblemente, dicha DNAsa es predominantemente una DNAsa específica de doble hebra, y preferiblemente DNAsa I o nucleasa Shrlmp.

En otra realización particular, que no es mutuamente exclusiva con la descrito anteriormente, se añade proteinasa K, ya sea durante el paso b) o antes del paso c).

Breve descripción de las figuras

Todas las figuras comprenden un panel superior que representa una curva de amplificación qPCR y un panel inferior que representa un análisis de la curva de fusión. Las curvas de amplificación que aparecen más a la izquierda corresponden a réplicas de las mediciones, mientras que las curvas de amplificación que aparecen más a la derecha corresponden a los controles sin adición de enzima Transcriptor. Los picos de fusión en el lado derecho corresponden a productos de amplificación específicos de réplicas, mientras que los picos de fusión en el lado más a la Izquierda corresponden a la formación de dímero cebador en los controles sin enzima Transcriptor.

Figura 1 qPCR y análisis de curva de fusión de la expresión de ACTB en astrocitos de ratón de acuerdo con la presente invención tal como se realiza en el ejemplo 1 (dilución de muestra 1:1)

Figura 2 qPCR y análisis de la curva de fusión de la expresión de ACTB en astrocitos de ratón de acuerdo con la presente invención tal como se realiza en el ejemplo 1 (dilución de muestra 1:4)

Figura 3 qPCR y análisis de la curva de fusión de la expresión de TUBB5 en astrocitos de ratón de acuerdo con la presente Invención tal como se realiza en el ejemplo 1 (dilución 1:1)

Figura 4 qPCR y análisis de la curva de fusión de la expresión de ACTB en células PleLa de acuerdo con la presente invención tal como se realiza en el ejemplo 1 (dilución 1:1)

Descripción detallada

De acuerdo con la presente invención, es posible realizar una lisis de las células eucariotas adherentes o Incluso células procarlotas en un determinado recipiente de cultivo y en el mismo recipiente de cultivo en el que se realiza una reacción de la transcriptasa inversa con el fin de generar una sola hebra de cDNA.

Por lo tanto, la presente Invención más precisamente está dirigida a un método para realizar una RT-PCR para amplificar un RNA diana que comprende los pasos de

a) el cultivo de una población de células adherentes en un recipiente de cultivo de células

b) la lisis de dicha población de células adherentes que se supone que contiene dicho RNA diana en dicho recipiente de muestras con un tampón de lisis que comprende entre ,5 M y 1 M de un agente caotrópico

c) la adición de reactivos a dicho recipiente de muestras que son necesarios para realizar una reacción de transcripción Inversa de forma que el agente caotrópico está presente en una concentración de aproximadamente de 1 a 6 mM en dicho recipiente de muestras, y la transcripción reversa de dicho RNA diana en la primera hebra de cDNA

d) amplificar dicha primera hebra de cDNA por medio de la realización de múltiples ciclos de un protocolo de termociclado.

Por lo tanto, el cultivo celular, la lisis, y la... [Seguir leyendo]

1. Método para realizar una RT-PCR para amplificar un RNA diana que comprende los pasos de

a) el cultivo de una población de células adherentes en un recipiente de cultivo de células

b) la llsis de dicha población de células adherentes que se supone que contiene dicho RNA diana en dicho recipiente de muestras con un tampón de lisis que comprende entre ,5 M y 1 M de un agente caotrópico

c) la adición de reactivos a dicho recipiente de muestras que son necesarios para realizar una reacción de transcripción inversa de forma que el agente caotrópico está presente en una concentración de aproximadamente de 1 a 6 mM en dicho recipiente de muestras, y la transcripción reversa de dicho RNA diana en la primera hebra de cDNA

d) amplificar dicha primera hebra de cDNA mediante la realización de múltiples ciclos de un protocolo de termociclado.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el paso de amplificación se monitoriza en tiempo real.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-2 en el que dicho agente caotrópico es tiocianato de guanidina.

4. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, en el que dicho tampón de lisis comprende entre aproximadamente ,2 y ,5 M de agente caotrópico.

5. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, en el que el paso b) se lleva a cabo en presencia de un detergente no iónico que es preferiblemente NP4, y en el que dicho detergente no iónico durante el paso c) tiene un V/Vde ,1 a 2%.

6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, en el que se añade una DNAsa entre el paso b) y c).

7. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, en donde la proteinasa K se añade ya sea durante el paso b) o

antes del paso c).