L-arabinosa-isomerasa para la conversión de D-galactosa en D-tagatosa en un producto lácteo que contiene D-galactosa.

Uso de una L-arabinosa-isomerasa para la conversión de D-galactosa en D-tagatosa directamente en un producto lácteo que contiene D-galactosa,

en el que dicho producto lácteo que contiene D-galactosa se selecciona del grupo que consta de leche, leche enriquecida con D-galactosa, leche que experimenta fermentación láctica, una leche fermentada y leche en la que la lactosa se ha procesado enzimáticamente .

L-arabinosa-isomerasa para la conversión de D-galactosa en D-tagatosa en un producto lácteo que contiene D- galactosa 5

[0001] La presente invención se refiere al uso de una L-arabinosa-isomerasa para la conversión de D- galactosa en D-tagatosa en un producto lácteo que contiene D-galactosa, en que dicho producto lácteo que contiene D-galactosa se selecciona del grupo que consta de leche, leche enriquecida con D-galactosa, leche que experimenta fermentación láctica, una leche fermentada y leche en la que la lactosa se ha procesado enzimàticamente, a un

10 procedimiento para la conversión de D-galactosa en D-tagatosa durante la fermentación láctica de la leche, a un procedimiento para la producción de un producto lácteo fermentado edulcorado y a un aditivo edulcorante para un producto lácteo que comprende una L-arabinosa-isomerasa y/o un microorganismo que expresa una L-arabinosa- isomerasa aceptable para el consumo alimentario. La invención también se refiere a un microorganismo aceptable para el consumo alimentario que expresa una L-arabinosa-isomerasa exógena y a una L-arabinosa-isomerasa 15 US100 de Bac/7/L/s sfearofbermopMus mutada, en particular a un mutante con una mayor tolerancia a la acidez y estabilidad a pH ácido o a un mutante con una temperatura óptima inferior.

[0002] Las bacterias lácticas (BL) constituyen un grupo comercialmente importante de microorganismos utilizado ampliamente en la industria alimentaria. Entre estas, los iniciadores lácteos Lacfobac///us de/brueck/7, subsp.

20 bu/gar/cus (L. ÓL//gancL/s) y Sfrepfococcus f/rermopMus se usan universalmente de manera conjunta en la fermentación de la leche a yogur (lamine y Robinson, 1999, Yoghurt Science and Technology, 2.^ edición, Cambridge: Woodhead). Durante su crecimiento, como principal fuente de energía, se usa la lactosa, que es el único azúcar que se encuentra en la leche.

25 [0003] En las BL se conocen dos sistemas para el transporte y metabolismo de la lactosa: (i) un sistema de lactosa-fosfotransferasa (PTS) dependiente de fosfoenolpiruvato (PEP) con un sistema de fosfo-)3-galactos¡dasa (Postma y col., 1993, Microbiol Rev., 57: 543-94) y (¡i) un sistema de lactosa-permeasa de antiporte (LacS) con una p-galactosidasa (LacZ). El sistema PTS-PEP se encuentra en muchas especies incluidos los lactococos (Reizer y col., 1988, Crit. Rev. Microbiol., 15: 297-338; Thompson, 1987, FEMS Microb. Lett., 46: 221-23). Tanto L. bu/gar/cus 30 como S. fbermop/i/Vus utilizan la lactosa mediante la segunda ruta, en la que la lactosa se introduce en la célula como azúcar libre y es escindido por la [3-galactosidasa en glucosa y galactosa (Foucaud y Poolman, 1992, J. Biol. Chem., 267: 22087-94; Leong-Morgenthalery col., 1991, J. Bacteriol., 173: 1951-7). La fracción de la glucosa de los monosacáridos generados se metaboliza posteriormente a piruvato, el cual se usa para producir lactato, mientras que la fracción de la galactosa es excretada por la mayor parte de las cepas de estas especies al medio en 35 cantidades equimolares con la absorción de la lactosa, a pesar de que estos iniciadores contienen los genes de la ruta de Lelolr, que es la ruta más extendida para el catabolismo de la galactosa en estas bacterias (de Vin y col., 2005, Appi Envlron. Microbiol., 71: 3659-67; Hickey y col., 1986, Appi. Environ. Microbiol., 51: 825-831; Hutkins y Ponne, 1991, Appi. Envlron. Microbiol., 57: 941-944). Actualmente, el fenotipo negativo para galactosa se atribuye principalmente a un defecto en el mecanismo de inducción de las enzimas de la ruta de Leloir durante el crecimiento 40 en lactosa y al modo de acción preferido de antiporte de la permeasa LacS /n v/vo (de Vin y col., 2005, Appi. Environ. Microbiol., 71: 3659-67; Turnery Martley, 1983, Appi. Environ. Microbiol., 45: 1932-1934).

[0004] Recientemente, se ha propuesto también leche con menor concentración de lactosa para las personas con intolerancia a la lactosa. La hidrólisis de la lactosa puede conseguir esta disminución de la concentración de

45 lactosa con la producción de glucosa y galactosa. Los inventores han demostrado que la L-arabinosa-isomerasa (L- Al) puede usarse para convertir la galactosa que resulta de la hidrólisis de la lactosa en la edulcorante e hipocalórica D-tagatosa.

[0005] En la fabricación de yogur, especialmente en el caso de los productos con frutas/sabores, se añaden 50 normalmente compuestos edulcorantes de gran valor calórico como la sacarosa para atenuar la acidez del producto.

Dado que en la actualidad estamos asistiendo a un aumento de la demanda productos alimenticios hipocalóricos por parte del consumidor, especialmente en el caso de diabetes o de personas con dietas hipocalóricas, el verdadero reto es tratar de convertir la D-galactosa no consumida durante la producción del yogur en un edulcorante hipocalórico como la D-tagatosa, lo que podría minimizar la habitual adición de azúcares hipercalóricos. Este 55 isómero natural de la D-galactosa es una cetohexosa rara con un poder edulcorante equivalente a la sacarosa, pero un valor calórico muy inferior, ya que es difícil de degradar por el cuerpo humano, lo que la hace un agente antihiperglucémico interesante.

[0006] No existe ninguna fuente biológica disponible para una extracción rentable de tagatosa. Se han

descrito dos procesos para la producción biológica de este edulcorante. El primero se basa en la capacidad de muchos microorganismos, como Arí/rroóacfer, Lacfobac/V/us, Myco6acfer/um, K/ebs/e//a y G/uconoóacfer, para convertir D-galacitol en D-tagatosa (Muniruzzaman y col., J. Ferment. Bioeng., 78 (1994) 145-148.; Shimonishi y col., J. Ferment. Bioeng., 79 (1995) 620-622.; Manzoni y col., Pro. Biochem., 36 (2001) 917-977; Rollini y Manzoni, Proc. 5 Biochem., 40 (2005) 437-444). Sin embargo, no tiene uso industrial porque el D-galacitol es un sustrato costoso con bajo potencial de aplicación industrial. El segundo es una isomerización enzimàtica /n v/fro de la D-galactosa, con el uso de la actividad de una L-arabinosa-isomerasa (L-AI) (Haltrich y col., 1998, Ann. N. Y. Acad. Sci., 864: 295-9; Izumorl y col., 1978, J. Bacteriol., 133: 413-4; Jorgensen y col., 2004, Appi. Microbiol. Biotechnol., 64: 816-22; Manzoni y col., 2001, Process Blochemistry, 36: 971-977). La enzima está implicada /n v/vo en la isomerización de L- 10 arablnosa a L-rlbulosa.

[0007] La L-arablnosa-isomerasa derivada de B. sfearof/rermop/r//us US100 (L-AI US100) ha sido caracterizada (solicitud de patente Internacional WO 2006/071203; Rhimi y Bejar, 2006, Biochim. Biophys. Acta, 1760: 191-9). La L-AI US100 tiene una actividad óptima a pH 7,5 y a 80 °C y, al contrario que la L-AI caracterizada

15 anteriormente, tiene pocos requerimientos de Iones metálicos.

[0008] Los inventores han demostrado que la L-AI US100 producida por bacterias lácticas es activa /n v/vo, ya que confiere una bioconversión eficaz de D-galactosa en D-tagatosa que es secretada por las células microbianas al medio de cultivo. Además, también se ha encontrado que la enzima L-AI US100 purificada convierte eficazmente D-

20 galactosa en D-tagatosa en la leche, el medio Industrial usado para la producción de yogur y también varios productos probióticos. Estos resultados prevén la explotación de la actividad de la L-AI para la producción de nuevos productos lácteos hlpocalórlcos que contengan D-tagatosa producida por isomerización enzimàtica.

[0009] La isomerización de la D-galactosa por L-arabinosa-isomerasas a alta temperatura aumenta la 25 velocidad de reacción y permite desplazar el equilibrio entre D-galactosa y D-tagatosa hacia esta última. Por esta

razón, se han aislado y caracterizado numerosas L-AI termoestables, incluidas las de los géneros Thermos, 7/iermofoga y Geoóac///us. Sin embargo, la mayoría de estas enzimas tiene un pH óptimo alto, lo que es una Importante desventaja con respecto a su aplicación durante la fermentación láctica, en la que el pH de la leche estará lejos del pH óptimo de la enzima.

[0010] La obtención de una nueva L-arabinosa-isomerasa tolerante a la acidez por ingeniería de proteínas se ha explorado previamente con el fin de encontrar L-AI activas a pH ácido. De hecho, Kim y col., 2006, describieron que las sustituciones V408R y N475Q permiten desplazar el pH óptimo de la L-AI T6 de Geoóac///us sfearof/iermopMus desde 8,5 a 7,5 (J. Appi. Microbiol., 101 (2006) 213). Además, Lee y col. describieron por

35 primera vez la caracterización de una nueva L-AI tolerante a la acidez del acidófilo A//cyc/oóac///us ac/doca/dar/us (Appi. Envlron. Microbiol., 71 (2005) 7888). Sin embargo, mientras que esta L-AI mutante es tolerante a la acidez, requiere cationes divalentes tanto para su actividad como para su estabilidad... [Seguir leyendo]

1. Uso de una L-arab¡nosa-¡somerasa para la conversión de D-galactosa en D-tagatosa directamente en un producto lácteo que contiene D-galactosa, en el que dicho producto lácteo que contiene D-galactosa se

5 selecciona del grupo que consta de leche, leche enriquecida con D-galactosa, leche que experimenta fermentación láctica, una leche fermentada y leche en la que la lactosa se ha procesado enzimáticamente.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha L-arabinosa-isomerasa se deriva de una bacteria seleccionada del grupo que consta de una bacteria del género 7ihermus, íhermofoga, Geoóac/Wus,

10 Lacíoóac/7/L/s y Sac///us, de A//cyc/oóac///us ac/doca/dar/us y de una bacteria láctica.

3. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha L-arabinosa-

isomerasa se selecciona del grupo que consta de AAAI, AAAI-K269E, BHAI, BHAI-E268K, L-AI US100, L-AI US100 que comprende una sustitución de Q por K en la posición 268 de SEQ ID NO:2, L-AI US100 que comprende una

15 sustitución de N por H en la posición 175 de SEQ ID NO:2 y L-AI US100 que comprende una sustitución de N por H

en la posición 175 y de Q por K en la posición 268 de SEQ ID NO:2.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos un microorganismo

que expresa una L-arabinosa-isomerasa se añade al producto lácteo que contiene D-galactosa o se pone en

20 contacto con el mismo.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho microorganismo que expresa una L- arabinosa-isomerasa se ha transformado para expresar la L-arabinosa-isomerasa o expresa la L-arabinosa- isomerasa de manera natural.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en el que dicho microorganismo que expresa una L- arabinosa-isomerasa es una bacteria láctica.

7. Un procedimiento para la conversión de la D-galactosa producida por la fermentación láctica de la 30 leche en D-tagatosa que comprende las etapas de:

a) adición a la leche de al menos una L-arabinosa-isomerasa y/o un microorganismo que expresa una L-arabinosa- isomerasa aceptable para el consumo alimentario; y

35 b) realización de la fermentación láctica de la leche;

con lo que la D-galactosa producida en la leche por la fermentación láctica se convierte en D-tagatosa.

8. Un procedimiento para la conversión de la D-galactosa producida por la fermentación láctica de la 40 leche en D-tagatosa, en que el procedimiento comprende las etapas de:

a) puesta en contacto de la leche con al menos una L-arabinosa-isomerasa y/o un microorganismo que expresa una L-arabinosa-isomerasa; y

45 b) realización de la fermentación láctica de la leche;

con lo que la D-galactosa producida en la leche durante la fermentación láctica se convierte en D-tagatosa.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que dicho microorganismo que expresa 50 una L-arabinosa-isomerasa es una bacteria láctica.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicha L- arabinosa-isomerasa se selecciona del grupo que consta de AAAI, AAAI-K269E, BHAI, BHAI-E268K, L-AI US100, L- Al US100 que comprende una sustitución de Q por K en la posición 268 de SEQ ID NO:2, L-AI US100 que

55 comprende una sustitución de N por H en la posición 175 de SEQ ID NO:2 y L-AI US100 que comprende una sustitución de N por H en la posición 175 y de Q por K en la posición 268 de SEQ ID NO:2.

11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que dicho microorganismo que expresa una L-arabinosa-isomerasa se ha transformado para expresar la L-arabinosa-

¡somerasa o expresa ¡a L-arab¡nosa-¡somerasa de manera natural.

12. Un procedimiento para la producción de un producto lácteo fermentado edulcorado que comprende las etapas de:

a) adición de al menos una L-arabinosa-isomerasa y/o un microorganismo que expresa una L-arabinosa-isomerasa aceptable para el consumo alimentario a dicho producto lácteo fermentado; o

b) puesta en contacto de dicho producto lácteo que contiene D-galactosa con al menos una L-arabinosa-isomerasa 10 y/o un microorganismo que expresa una L-arabinosa-isomerasa,

con lo que se obtiene un producto lácteo fermentado edulcorado.

13. Un aditivo edulcorante para la leche que comprende una L-arabinosa-isomerasa y/o un 15 microorganismo que expresa una L-arabinosa ¡somerasa.

14. Una bacteria aceptable para el consumo alimentario que expresa una L-arabinosa-isomerasa exógena.

20 15. La bacteria de acuerdo con la reivindicación 15, que se ha transformado con un vector que comprende

una secuencia de ácido nucleico que codifica una L-arabinosa-isomerasa.

16. La bacteria de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, que es una bacteria láctica.

25 17. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en que dicha L-arabinosa-

isomerasa se selecciona del grupo que consta de AAAI, AAAI-K269E, BHAI, BHAI-E268K, L-AI US100, L-AI US100 que comprende una sustitución de Q por K en la posición 268 de SEQ ID NO:2, L-AI US100 que comprende una sustitución de N por H en la posición 175 de SEQ ID NO:2 y L-AI US100 que comprende una sustitución de Q por K en la posición 268 y de N por H en la posición 175 de SEQ ID NO:2.

18. Un vector adecuado para la transformación de una bacteria, en que el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una L-arabinosa-isomerasa seleccionada entre las L-arab¡nosa-¡somerasas L-AI US100 que comprende una sustitución de Q por K en la posición 268 de SEQ ID NO:2, L-AI US100 que comprende una sustitución de N por H en la posición 175 de SEQ ID NO:2 y L-AI US100 que comprende una

35 sustitución de N por H en la posición 175 y de Q por K en la posición 268 de SEQ ID NO:2.

19. Una L-arabinosa-isomerasa US100 de SEQ ID NO:2 mutada que comprende una sustitución de Q por K en la posición 268 de SEQ ID NO:2 y/o una sustitución de N por H en la posición 175.

40 20. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica la L-arabinosa-isomerasa

US100 de SEQ ID NO:2 mutada que comprende una sustitución de Q por K en la posición 268 de SEQ ID NO:2 y/o una sustitución de N por H en la posición 175.