Inmunoglobulinas multivalentes modificadas en la región de bucle estructural.

Una inmunoglobulina multivalente o parte de la misma que se une específicamente a al menos dos moléculas de la superficie celular de una sola célula con al menos una modificación en al menos una región de bucles estructurales de dicha inmunoglobulina que determina la unión con un epítopo de dichas moléculas de superficie celular,

en donde la región de bucles estructurales modificada está dentro de un dominio constante de dicha inmunoglobulina y la modificación es una deleción, una sustitución, una inserción o una combinación de las mismas, y en donde la inmunoglobulina no modificada no se une significativamente a dicho epítopo.

Inmunoglobulinas multivalentes modificadas en la región de bucle estructural

La presente invención proporciona una inmunoglobulina multivalente, o una parte de la misma, que se une específicamente a al menos dos moléculas de la superficie celular de una sola célula, con al menos una modificación en al menos una región de bucles estructurales de dicha inmunoglobulina que determina la unión a un epítopo de dichas moléculas de la superficie celular, en que la inmunoglobulina no modificada no se une significativamente a dicho epítopo.

Los anticuerpos monoclonales tienen utilidad en muchas aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y analíticas.

Se explicará aquí la estructura básica de un anticuerpo usando como ejemplo una inmunoglobulina lgG1 intacta. Se combinan dos cadenas pesadas (H; del inglés, heavy) idénticas y dos cadenas ligeras (L; del inglés, light) idénticas para formar la molécula de anticuerpo con forma de Y. Cada cadena pesada tiene cuatro dominios." Los dominios variables (VH) amino-terminales están en las puntas de la Y. Estos van seguidos de tres dominios constantes: CH1, CH2 y el CH3 carboxi-terminal, en la base del tallo de la Y. Un tramo corto, el conmutador, conecta las regiones variable y constante de la cadena pesada. La bisagra conecta CH2 y CH3 (el fragmento Fe) con el resto del anticuerpo (los fragmentos Fab). En una molécula de anticuerpo intacta se pueden producir un fragmento Fe y dos fragmentos Fab idénticos por escisión proteolítica de la bisagra. Las cadenas ligeras están formadas por dos dominios, variable (VL) y constante (CL), separados por un conmutador.

En la región bisagra, enlaces disulfuro conectan las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras están conectadas con las cadenas pesadas por enlaces disulfuro adicionales. Componentes carbohidratados enlazados por Asn están fijados en diferentes posiciones de los dominios constantes, dependiendo de la clase de la inmunoglobulina. En la lgG1, dos enlaces disulfuro en la región bisagra, entre parejas de Cys235 y Cys238, unen las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras están conectadas con las cadenas pesadas por dos enlaces disulfuro adicionales, entre Cys229s de los dominios CH1 y Cys214s de los dominios CL. Componentes carbohidratados están fijados a la Asn306 de cada CH2, lo que genera un acusado abultamiento en el tallo de la Y.

Estas características tienen profundas consecuencias funcionales. Las regiones variables tanto de la cadena pesada (VH) como de la cadena ligera (VL) están situadas en las "puntas" de la Y, donde están dispuestas para reaccionar con el antígeno. Esta punta de la molécula es el lado sobre el que está situado el extremo N de la secuencia de aminoácidos. El tallo de la Y se proyecta de modo que media eficazmente en funciones efectoras, tales como la activación del complemento y la interacción con receptores de Fe, o ADCC y ADCP. Sus dominios CH2 y CH3 sobresalen para facilitar la interacción con proteínas efectoras. El extremo C de la secuencia de aminoácidos, que puede ser denominado "pie" de la Y, está situado en el lado opuesto de la punta.

En los anticuerpos se encuentran dos tipos de cadena ligera denominados lambda (X) y kappa (k). Una inmunoglobulina dada tiene cadenas X o cadenas k, nunca una de cada. No se han encontrado diferencias funcionales entre los anticuerpos que tienen cadenas ligeras X o k.

En una molécula de anticuerpo, cada dominio tiene una estructura similar de dos hojas beta íntimamente apiladas una contra otra en un barril beta antiparalelo comprimido. Esta estructura conservada se denomina "pliegue inmunoglobulínico". El pliegue inmunoglobulínico de dominios constantes contiene una hoja de 3 hebras apilada contra una hoja de 4 hebras. El pliegue es estabilizado por enlaces de hidrógeno entre las hebras beta de cada hoja, por enlaces hidrófobos entre restos de hojas opuestas en el interior y por un enlace disulfuro entre las hojas. La hoja de 3 hebras comprende las hebras C, F y G, y la hoja de 4 hebras tiene las hebras A, B, E y D. Las letras A a G representan las posiciones secuenciales de las hebras beta a lo largo de la secuencia de aminoácidos del pliegue inmunoglobulínico.

El pliegue de dominios variables tiene 9 hebras beta dispuestas en dos hojas de 4 y 5 hebras. La hoja de 5 hebras es estructuralmente homologa a la hoja de 3 hebras de los dominios constantes pero contiene las hebras extra C y C". El resto de las hebras (A, B, C, D, E, F, G) tiene una topología igual y una estructura similar a la de sus equivalentes en los pliegues inmunoglobulínicos de los dominios constantes. Como en los dominios constantes, un enlace disulfuro une las hebras B y F de hojas opuestas.

Los dominios variables de ambas cadenas inmunoglobulínicas, la ligera y la pesada, contienen tres bucles hipervariables, o regiones determinantes de la complementariedad (CDRs; del inglés, complementarity-determining regions). Las tres CDRs de un dominio V (CDR1, CDR2, CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDRs son bucles que conectan hebras beta B-C, C'-C" y F-G del pliegue inmunoglobulínico. Los restos de las CDRs varían de una molécula inmunoglobulínica a la siguiente, lo que imparte especificidad antigénica a cada anticuerpo.

Los dominios VL y VH de las puntas de las moléculas de anticuerpo están íntimamente apilados de modo que las 6 CDRs (3 de cada dominio) cooperan para construir una superficie (o cavidad) para una unión antigénicamente específica. De este modo, el sitio ligante de antígenos natural de un anticuerpo está compuesto de los bucles que

conectan las hebras B-C, C'-C" y F-G del dominio variable de cadena ligera y las hebras B-C, C'-C" y F-G del dominio variable de cadena pesada.

En una inmunoglobulina nativa, los bucles que no son bucles de CDR, o no forman parte de la cavidad ligante de antígenos según viene determinada por los bucles de CDR, no tienen una especificidad ligante de antígenos ni ligante de epítopos pero contribuyen a la plegadura correcta de la molécula inmunoglobulínica entera y/o a sus funciones efectoras u otras funciones, y, por lo tanto, son denominados "bucles estructurales" para la finalidad de esta invención. En los documentos de la técnica previa se muestra que se ha empleado hasta ahora el andamio de tipo inmunoglobulínico con el fin de manipular el sitio ligante de antígenos existente, introduciendo por ello nuevas propiedades ligantes. Sin embargo, hasta ahora, sólo se han alterado las regiones CDR para la unión de antígenos; en otras palabras, en el caso del pliegue inmunoglobulínico, sólo se ha modificado el sitio ligante de antígenos natural con objeto de cambiar su afinidad o especificidad de unión. Existe un vasto cuerpo bibliográfico en el que se describen diferentes formatos de dichas inmunoglobulinas manipuladas, frecuentemente expresados en forma de fragmentos Fv de cadena sencilla (scFV; del inglés, single-chain Fv) o fragmentos Fab, ya sea presentados en la superficie de partículas de fago o ya sea solublemente expresados en diversos sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos.

En el Documento PCT/EP2006/050059 se describe un método para alterar una inmunoglobulina, que comprende una modificación en una región de bucles estructurales para obtener nuevos sitios ligantes de antígeno. Este método es aplicable en gran medida a inmunoglobulinas y puede ser usado para producir una serie de inmunoglobulinas que se dirijan a diversos antígenos. No se describen explícitamente agentes ligantes multivalentes de dianas de la superficie celular.

En el Documento US2005/266000A1 se describen polipéptidos que comprenden un dominio de armazón variable (VFR) variante de cadena pesada. Un VFR es parte de la cavidad o acanaladura ligante de antígenos que puede entrar en contacto con un antígeno. Los VFRs son parte de la región de bucles de CDR y están situados en un dominio variable en el lado de los bucles de CDR para sostener la unión del antígeno a través de la región de bucles de CDR. Los bucles estructurales distintos de los VFRs no han sido mutados con el fin de alterar un sitio ligante de antígenos.

Las proteínas de superficie celular asociadas con cánceres humanos pueden ser dianas eficaces para una terapia monoclonal. Los anticuerpos pueden provocar respuestas antitumorales mediante modulación de la activación celular o a través del reclutamiento del sistema inmune. Ciertos anticuerpos monoclonales (mAbs; del inglés, monoclonal antibodies) ejercen parte de su efecto por entrecruzamiento de la diana, lo que puede agrupar las dianas y dar lugar a la activación, inhibición o multiplicación de la señalización celular, acabando finalmente en parada celular y/o apoptosis con respecto a la diana celular.

Se ha demostrado... [Seguir leyendo]

1. Una inmunoglobulina multivalente o parte de la misma que se une específicamente a al menos dos moléculas de la superficie celular de una sola célula con al menos una modificación en al menos una región de bucles estructurales de dicha inmunoglobulina que determina la unión con un epítopo de dichas moléculas de superficie celular, en donde la región de bucles estructurales modificada está dentro de un dominio constante de dicha inmunoglobulina y la modificación es una deleción, una sustitución, una inserción o una combinación de las mismas, y en donde la inmunoglobulina no modificada no se une significativamente a dicho epítopo.

2. Inmunoglobulina de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la región de bucles estructurales modificada está dentro de CH1, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C, o una parte del mismo.

3. Inmunoglobulina de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por que dicha región de bucles estructurales modificada comprende al menos 6 modificaciones de aminoácido.

4. Inmunoglobulina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que las regiones de bucles modificadas de un CH1, un CH2, un CH3 o un CH4 de origen humano o murino comprenden al menos una modificación en los aminoácidos 7 a 21, los aminoácidos 25 a 39, los aminoácidos 41 a 81, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 89 a 103 o los aminoácidos 106 a 117.

5. Inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que las regiones de bucles de Igk-C o Igl-C de origen humano comprenden al menos una modificación en los aminoácidos 8 a 18, los aminoácidos 27 a 35, los aminoácidos 42 a 78, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 92 a 100, los aminoácidos 108 a 117 o los aminoácidos 123 a 126.

6. Inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que las regiones de bucles de Igk-C o Igl-C de origen murino comprenden al menos una modificación en los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 26 a 36, los aminoácidos 43 a 79, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 90 a 101, los aminoácidos 108 a 116 o los aminoácidos 122 a 125.

7. Inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que el dominio constante de inmunoglobulina es de origen camélido.

8. Inmunoglobulina de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada por que la inmunoglobulina comprende al menos un dominio constante modificado seleccionado del grupo que consiste en CH1, CH2 y CH3.

9. Inmunoglobulina de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que las regiones de bucles modificadas de un CH1, un CH2 y/o un CH3 comprenden al menos una modificación dentro de los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 24 a 39, los aminoácidos 42 a 78, los aminoácidos 82 a 85, los aminoácidos 91 a 103 o los aminoácidos 108 a 117.

10. Inmunoglobulina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada por que la inmunoglobulina modificada está además combinada con una o más inmunoglobulinas modificadas o con inmunoglobulinas no modificadas, o partes de las mismas, para obtener una inmunoglobulina de combinación.

11. Ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina o parte de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Método para alterar una inmunoglobulina multivalente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que comprende al menos una región de bucles estructurales dentro de un dominio constante,

- modificar al menos un resto nucleotídico de dicha región de bucles estructurales,

- transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión;

- expresar dicha inmunoglobulina multivalente;

- poner en contacto la inmunoglobulina multivalente expresada con un epítopo, y determinar si dicha inmunoglobulina multivalente se une a dicho epítopo.

13. Método para producir una inmunoglobulina multivalente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una preparación farmacéutica de la misma, y determinar la unión de dicha inmunoglobulina con un epítopo de un antígeno, en donde la inmunoglobulina no modificada no se une de forma significativa a dicho epítopo, que comprende las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que comprende al menos una región de bucles estructurales dentro de un dominio constante,

- modificar al menos un resto nucleotídico de al menos una de dichas regiones de bucles,

- transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión;

- expresar dicha inmunoglobulina modificada;

- poner en contacto la inmunoglobulina modificada expresada con un epítopo,

- determinar si dicha inmunoglobulina modificada se une con dicho epítopo, y

- proporcionar la inmunoglobulina modificada que se une con dicho epítopo y opcionalmente terminarla en una preparación farmacéutica.

14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la inmunoglobulina se une específicamente a al menos una primera molécula y comprende al menos una modificación en al menos una región de bucles estructurales de dicha inmunoglobulina, y el método comprende determinar la unión específica de dicha al menos una región de bucles estructurales con al menos una segunda molécula, en donde la inmunoglobulina que contiene una región de bucles estructurales no modificada no se une específicamente a dicha al menos una segunda molécula, que comprende las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que se une específicamente a al menos una primera molécula que comprende al menos una región de bucles estructurales dentro de un dominio constante,

- modificar al menos un resto nucleotídico de al menos una de dichas regiones de bucles codificadas por dicho ácido nucleico,

- transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión;

- expresar dicha inmunoglobulina modificada;

- poner en contacto la inmunoglobulina modificada expresada con dicha al menos una segunda molécula, y

- determinar si dicha inmunoglobulina modificada se une específicamente a la segunda molécula y

- proporcionar la inmunoglobulina modificada que se une específicamente a dicha al menos una segunda molécula y opcionalmente terminarla en una preparación farmacéutica.

15. Una inmunoglobulina multivalente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso como un medicamento.

16. Una inmunoglobulina multivalente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la que la inmunoglobulina multivalente es biespecífica.