Método para modificar receptores de células T.

Un método para modificar un polipéptido del dominio del receptor de células T que comprende una región bucle estructural para introducir un nuevo sitio de unión al antígeno en dicha región bucle estructural,

en que el bucle estructural no es un bucle CDR, y determinando la unión a un epítopo de dicho antígeno, en que el polipéptido del dominio del receptor de células T sin modificar no se une significativamente a dicho epítopo de dicho antígeno, que comprende las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido del dominio del receptor de células T que comprende al menos una región bucle estructural.

- modificar al menos un resto de nucleótido de al menos una de dichas regiones de bucle estructural por mutación aleatoria dirigida al sitio, en donde se intercambian o introducen dos o más restos de aminoácido específicos de los bucles utilizando insertos generados aleatoriamente en tales bucles estructurales,

- transferir dicho ácido nucleico modificado en un sistema de expresión,

- expresar dicho polipéptido del dominio del receptor de células T modificado,

- poner en contacto el polipéptido del dominio del receptor de células T expresado con dicho epítopo, y

- determinar si dicho polipéptido del dominio del receptor de células T se une a dicho epítopo.

Método para modificar receptores de células T Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método nuevo para modificar genéticamente los receptores de células T y los polipéptidos del dominio del receptor de células T con el objetivo de dotarlos de propiedades específicas de unión. Además, se desvelan polipéptidos del dominio del receptor de células T obtenidos por dicho método y su utilización para establecer bibliotecas y desarrollar métodos de detección y selección de posibles estructuras de unión.

Antecedentes

Los receptores de las células T (TCR) son moléculas importantes del sistema inmunitario. Sus dominios extracelulares son homólogos con y estructuralmente similares a un fragmento Fab de anticuerpo.

Los receptores de células T se expresan de modo natural en la superficie de las células T normalmente como integrantes heterodiméricos alfa/beta y gama/delta de las proteínas de membrana, cada subunidad comprende un segmento corto intracelular, una hélice alfa única transmembranosa y dos dominios globulares extracelulares de la superfamilia Ig. El heterodímero TCR se estabiliza por un enlace disulfuro intercatenario extracelular, membranario proximal (Immunobiology. 5a ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Shlomchik, Mark. New York and London: Garland Publishing; 21).

Los TCR por lo tanto tienen cuatro dominios extracelulares, los dos dominios membranarios proximales (extremo C), que son constantes, y los dos dominios del extremo N que son variables. Los dominios variables están codificados por segmentos genéticos variables que se reordenan con segmentos de unión y constantes (y segmentos genéticos de diversidad en el caso de cadenas (3) para producir la diversidad de TCR que se observa en el sistema inmunitario maduro.

Tanto los dominios variables como los dominios constantes de los receptores de células T son estructuralmente similares a los dominios de anticuerpo y muestran el típico "plegamiento de inmunoglobulinas".

Cada dominio tiene una estructura similar de las dos láminas beta incluidas apretadamente una con otra en un barril beta antiparalelo comprimido.

El plegamiento de inmunoglobulina de los dominios constantes de TCR (dominios C) contiene una lámina de 3 cadenas incluida con una lámina de 4 cadenas. El plegamiento se estabiliza por enlaces de hidrógeno entre las cadenas beta de cada lámina, por enlace hidrofóbico entre los restos de láminas opuestas en el interior, y por un enlace disulfuro entre las láminas. Las cadenas con 3 cadenas se designan C, F y G, y la lámina de 4 cadenas comprende las cadenas A, B, D y E. Las letras de A a G denotan posiciones secuenciales de las cadenas beta a lo largo de la secuencia de aminoácidos del pliegue de inmunoglobulina.

El pliegue de los dominios variables (dominios V) tiene 9 cadenas beta dispuestas en dos láminas de 4 y 5 cadenas. La lámina de 5 cadenas es estructuralmente homologa a la lámina de 3 cadenas de los dominios constantes, pero contiene las cadenas extras C y C". El resto de cadenas (A, B, C, D, E, F, G) tienen la misma topología y estructura similar que sus equivalentes de los plegamientos de inmunoglobulina del dominio constante.

Un enlace disulfuro une las cadenas B y F en láminas opuestas, como en los dominios constantes.

Toda la numeración de las secuencias de aminoácidos y la designación de los bucles proteicos y láminas de los TCR son de acuerdo con el esquema de numeración IMGT (IMGT, the international ImMunoGeneTics information system@imgt.cines.fr ; http://imat.cines.fr ; Lefranc et al., (23) Dev Comp Immunol 27:55 77.; Lefranc et al. (25) Dev Comp Immunol 29:185-23).

Los dominios variables de ambas cadenas de TCR contienen tres bucles hipervariables, o regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las tres CDR de un dominio V (CDR1, CDR2, CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDR son bucles que conectan cadenas beta B-C, C-C", y F-G del plegamiento de inmunoglobulina. Los restos en las CDR varían de una molécula de TCR a la siguiente, dotando cada TCR de especificidad antigénica.

Los dominios V y la inclinación de las moléculas TCR están empaquetadas estrechamente tal que las 6 CDR (3 del dominio variable) cooperan en la construcción de una superficie (o cavidad) para la unión específica al antígeno. El sitio de unión al antígeno natural de un TCR está compuesto por los bucles que conectan las cadenas B-C, C-C", y F-G del dominio variable de cadena ligera y las cadenas B-C, C-C", y F-G del dominio variable de cadena pesada. La extensión de la contribución específica para la unión al antígeno de los seis bucles de CDR pueden variar entre TCR diferentes.

Se ha demostrado que los receptores de células T tienen un potencial terapéutico y diagnóstico y se pueden modificar de forma similar que las moléculas de anticuerpo (por ejemplo, Molloy et al. Curr Opin Pharmacol. (25) 5:438-443; Boulter & Jakobsen (25) Clin Exp Immunol. 142:454-46; Simón et al (1992) Protein Engineerings 5: 229-234).

Se demostrado la clonación y expresión de receptores solubles y anclados a células T en varios formatos (por ejemplo, Moysey et al. (24) Anal Biochem. 326:284-286; Wulfing & Plueckthun (1994) J Mol Biol.242:655-669; Boulter et al. (23) Protein Eng. 16:77-711; Schodin et al. (1996) Mol Immunol 33:819 829; Chung et al. (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:12654 12658; Plaksin et al. (1997) J Immunol 158:2218 2227; Willcox et al. (1999) Protein Sci 8:2418 2423; Weber et al. (25) Proc Nati Acad Sci USA. 12:1933-1938; W4575A2; WO961815A1; WO433685A1; WO266636A2). El documento WO259263C2 describe animales transgénicos que comprenden un sistema inmunitario humanizado para desarrollar moléculas TCR humanas.

Se ha demostrado la generación de uniones de alta afinidad y se han seguido de forma similar a las tecnologías de maduración de afinidad de anticuerpos (por ejemplo, Boulter et al. Nat Biotechnol. (25) 23:349-354; Chlewicki et al. (25) J Mol Biol. 346:223-239;

Laugel et al. J.Biol. Chemistry 28(3) 1882-1892 (25); Monza et al. PNAS 13(26)9867-9872 (26);

Shusta et al. (2) 18:754-759; Holler et al. (2) Proc Nati Acad Sci USA 97:5387 92). Los documentos W4444A2, WO5116646A1 y W9839482A1 describen ribosomas y fagos de presentación de cadenas de TCR y métodos para seleccionar moléculas TCR contra antígenos específicos. El documento WO148145A2 describe los TCR de alta afinidad. La modificación de los dominios variables extracelulares de los receptores de células T se han caracterizado con el fin de modificación de la especificidad por medio de la modificación de las regiones CDR (documentos WO5114215A2; WO155366C2).

Los bucles CDR de un dominio TCR variable definen la especifidad por el antígeno. El resto del dominio se denomina matriz (FR). Estas regiones matriz se componen de estructuras de cadena beta y bucles.

Los bucles que no son bucles CDR en un dominio TCR nativo no tienen especificidad de unión antigénica o unión a epítopos pero contribuyen al plegamiento general correcto del dominio TCR y en consecuencia también al posicionamiento correcto de las CDR y la interacción entre dominios. Estos bucles se denominan bucles estructurales para los fines de la presente invención.

Las regiones matriz de dominios TCR se han modificado por ejemplo, por estabilización de los dímeros. Los documentos W63796A2 y WO656733A1 describen la introducción de un enlace disulfuro intercatenario no nativo. El documento WO157211A1 describe la heterodimerización de cadenas de TCR por fusión de péptidos con cremallera de leucina.

El documento EP6413B1 describe proteínas análogas de la superfamilia de inmunoglobulinas quiméricas (proteínas chi) que tienen más de un sitio biológico de unión (dominios V sencillos o Fvs). Los sitios de unión en estas proteínas están compuestos por regiones hipervariables derivadas de moléculas relacionadas con la superfamilia de inmunoglobulinas, que incluye inmunoglobulinas, antígenos de superficie celular (tales como antígenos de células T) y receptores celulares (tales como el receptor Fe). Las regiones hipervariables se llaman "regiones tipo CDR" y definen sitios de unión al ligando. Adicionalmente, la proteína-chi tiene al menos un segmento de sitio de unión al ligando más, también una región tipo CDR, empalmados en las regiones tipo FR del dominio del barril beta.

Cada sitio de unión al ligando de la proteína-chi por lo tanto está compuesto por una región tipo CDR derivada de moléculas de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Por ejemplo, un sitio de unión al ligando de las CDR derivadas de una molécula de inmunoglobulina cuyo ligando es un antígeno.

El documento EP6413B1 por tanto... [Seguir leyendo]

1. Un método para modificar un polipéptido del dominio del receptor de células T que comprende una región bucle estructural para introducir un nuevo sitio de unión al antígeno en dicha región bucle estructural, en que el bucle estructural no es un bucle CDR, y determinando la unión a un epítopo de dicho antígeno, en que el polipéptido del dominio del receptor de células T sin modificar no se une significativamente a dicho epítopo de dicho antígeno, que comprende las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido del dominio del receptor de células T que comprende al menos una región bucle estructural.

- modificar al menos un resto de nucleótido de al menos una de dichas regiones de bucle estructural por mutación aleatoria dirigida al sitio, en donde se intercambian o introducen dos o más restos de aminoácido específicos de los bucles utilizando insertos generados aleatoriamente en tales bucles estructurales,

- transferir dicho ácido nucleico modificado en un sistema de expresión,

- expresar dicho polipéptido del dominio del receptor de células T modificado,

- poner en contacto el polipéptido del dominio del receptor de células T expresado con dicho epítopo, y

- determinar si dicho polipéptido del dominio del receptor de células T se une a dicho epítopo.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido del dominio del receptor de células T se une específicamente a al menos dos epítopos.

3. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que se caracteriza por que el polipéptido del dominio del receptor de células T es de origen humano o murino.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza por que el polipéptido del dominio del receptor de células T se deriva de un dominio del receptor de células T que se selecciona de entre el dominio variable o constante, preferentemente de entre el grupo que consiste en V-alfa, V-beta, V- gamma, V-delta, C-alfa, C-beta, C-gamma, C-delta.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza por que las regiones bucle modificadas de los dominios variables comprenden al menos una modificación en los aminoácidos 11 a 19, aminoácidos 43 a 51, aminoácido 67 a 8 o aminoácidos 9 a 99, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de los dominios es la del esquema de numeración ImMunoGeneTics (IMGT).

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza por que las regiones bucle modificadas de los dominios constantes comprenden al menos una modificación en los aminoácidos 9 a 2, aminoácidos 27 a 36, aminoácidos 41 a 78, aminoácidos 82 a 85, aminoácidos 9 a 12 o aminoácidos 17 a 116, en donde la numeración de la posición de aminoácidos de los dominios es la del esquema de numeración IMGT.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se caracteriza por que la modificación de al menos un nucleótido de un ácido nucleico da como resultado una sustitución, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos del polipéptido del dominio del receptor de células T codificado por dicho ácido nucleico.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se caracteriza por que al menos un aminoácido de al menos una región bucle estructural está modificada por una mutación aleatoria dirigida al sitio.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, que se caracteriza por que la molécula de ácido nucleico modificada aleatoriamente comprende al menos una unidad de repetición de nucleótido que tiene la secuencia codificante NNS, NNN, NNK, TMT, WMT, RMC, RMG, MRT, SRC, KMT, RST, YMT, MKC, RSA, RRC, en donde la codificación es según la IUPAC.