Dominios de inmunoglobulinas sintéticas con propiedades de unión modificadas en regiones de la molécula diferentes de las regiones que determinan la complementariedad.

Un dominio variable de inmunoglobulina, o una parte de este, que comprende al menos una región de bucle estructural de un dominio variable de la cadena pesada o ligera de una inmunoglobulina,

comprendiendo dicha al menos una región de bucle estructural al menos una modificación para proporcionar un sitio de unión que no es una CDR que se une a un epitopo de un antígeno, no uniéndose dicha región de bucle estructural no modificada a dicho epitopo, en el que dicha modificación comprende una mutagénesis en un bucle inferior seleccionado del grupo que consiste en los bucles que conectan las cadenas beta A-B, C-C', C''-D y E-F del dominio variable.

Dominios de inmunoglobulinas sintéticas con propiedades de unión modificadas en regiones de la molécula diferentes de las regiones que determinan la complementariedad Campo de la invención La presente invención se refiere a un dominio variable de inmunoglobulina modificado.

El campo general corresponde a la modificación de proteínas con el objetivo de impartirlas unas propiedades de unión específica. De modo más concreto, las proteínas modificadas pertinentes en la presente son inmunoglobulinas (anticuerpos) , y aún más concretamente, dominios individuales o parejas o combinaciones de dominios individuales de inmunoglobulinas. Las propiedades de unión específica de las inmunoglobulinas son características importantes, puesto que controlan la interacción con otras moléculas, tales como antígenos, y hacen que las inmunoglobulinas sean útiles para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.

La estructura básica de los anticuerpos se explicará en la presente utilizando como ejemplo una inmunoglobulina IgG1 intacta.

Dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras (L) idénticas se combinan para formar la molécula en forma de Y del anticuerpo. Las cadenas pesadas tienen cada una cuatro dominios. Los dominios variables aminoterminales (VH) se encuentran en los extremos de la Y. Tras ellos se encuentran tres dominios constantes: CH1, CH2, y el carboxi-terminal CH3, en la base del tronco de la Y. Un tramo corto, el interruptor, conecta las regiones variable y constante de la cadena pesada. La bisagra conecta CH2 y CH3 (el fragmento Fc) al resto del anticuerpo (los fragmentos Fab) . Puede producirse un fragmento Fc y dos fragmentos Fab idénticos mediante la ruptura proteolítica de la bisagra en una molécula de anticuerpo intacta. Las cadenas ligeras están construidas por dos dominios, uno variable (VL) y otro constante (CL) , separados por un interruptor.

Las dos cadenas pesadas están conectadas por enlaces disulfuro en la región bisagra. Las cadenas ligeras están acopladas a las cadenas pesadas mediante otros enlaces disulfuro. En los dominios constantes, en diferentes posiciones, aparecen restos carbohidatos enlazados a través de Asn, dependiendo de la clase de inmunoglobulina. Para IgG1, dos enlaces disulfuro en la región bisagra, entre las parejas Cys235 y Cys238, unen las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras están acopladas a las cadenas pesadas mediante dos enlaces disulfuro adicionales, entre Cys229s en los dominios CH1 y Cys214s en los dominios CL. Aparecen restos carbohidratos unidos a Asn306 de cada CH2, generando una protuberancia prominente en el tronco de la Y.

Estas características tienen profundas consecuencias funcionales. Las regiones variables de ambas cadenas pesada (VH) y ligera (VL) se encuentran en los "extremos" de la Y, en donde están colocadas para que reaccionen con el antígeno. Este extremo de la molécula es el lado en el que está localizado el N-terminal de la secuencia de aminoácidos. El tronco de la Y sobresale de tal modo que media de forma eficaz en las funciones efectoras, tales como la activación del complemento y la interacción con los receptores de Fc, o ADCC y ADCP. Sus dominios CH2 y CH3 sobresalen para facilitar la interacción con proteínas efectoras. El C-terminal de la secuencia de aminoácidos se localiza en el lado opuesto del extremo, que puede denominarse "parte baja" de la Y. La estructura de una IgG1 intacta se ilustra en la figura 1a.

En los anticuerpos se encuentran dos tipos de cadenas ligeras, denominadas lambda (A) y kappa (K) . Una inmunoglobulina concreta tiene cadenas K o cadenas A, nunca una de cada. No se han descubierto diferencias funcionales entre los anticuerpos que tienen cadenas ligeras A o K.

La organización estructural de los monómeros de la principal clase de inmunoglobulinas humanas se muestra en la figura 1b. Las clases se diferencian en la composición y en la secuencia de sus respectivas cadenas pesadas. Ambas IgM e IgE carecen de una región bisagra pero cada una contiene un dominio de cadena pesada adicional (CH4) . El número y las localizaciones de los enlaces disulfuro (líneas) que conectan las cadenas se diferencian entre los isotipos. También se diferencian en la distribución de los grupos carbohidratos N-conectados, que se muestran simbólicamente como círculos.

Cada dominio en una molécula de anticuerpo tiene una estructura similar de dos láminas beta muy compactadas entre sí en un barril beta antiparalelo comprimido. Esta estructura conservada se denomina plegamiento de la inmunoglobulina. El plegamiento de la inmunoglobulina de dominios constantes contiene una lámina tricatenaria compactada junto a una lámina tetracatenaria. El plegamiento es estabilizado por enlaces de hidrógeno entre las cadenas beta de cada lámina, por enlaces hidrófobos entre restos de láminas opuestas en el interior, y por un puente disulfuro entre las láminas. La lámina tricatenaria comprende las cadenas C, F y G, y la lámina tetracatenaria tiene las cadenas A, B, E y D. Las letras A a G indican las posiciones secuenciales de las cadenas beta a lo largo de la secuencia de aminoácidos del plegamiento de la inmunoglobulina.

El plegamiento de dominios variables tiene 9 cadenas beta dispuestas en dos láminas de 4 y 5 cadenas. La lámina pentacatenaria es estructuralmente homóloga a la lámina tricatenaria de los dominios constantes, pero contiene dos cadenas más, C' y C''. El resto de las cadenas (A, B, C, D, E, F, G) tienen la misma topología y una estructura similar a sus homólogos en los plegamientos de inmunoglobulinas de dominios constantes. Un enlace disulfuro conecta las cadenas B y F en láminas opuestas, al igual que en los dominios constantes. El plegamiento de la inmunoglobulina se ilustra en la figura 2 para un dominio constante y un dominio variable de una inmunoglobulina.

Los dominios variables de ambas cadenas de inmunoglobulina ligera y pesada contienen tres bucles hipervariables, o regiones determinantes de la complementariedad (CDR) . Las tres CDR de un dominio V (CDR1, CDR2, CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDR son bucles que conectan las cadenas beta B-C, C'-C'', y F-G del plegamiento de la inmunoglobulina. Los restos en las CDR varían de una molécula de inmunoglobulina a otra, impartiendo especificidad de antígeno a cada anticuerpo.

Los dominios VL y VH en los extremos de las moléculas de anticuerpos están muy compactados entre sí de modo que las 6 CDR (3 en cada dominio) cooperan para construir una superficie (o cavidad) para la unión específica del antígeno. Por tanto, el sitio de unión al antígeno natural de un anticuerpo está compuesto por los bucles que conectan las cadenas B-C, C'-C'', y F-G del dominio variable de cadena ligera, y las cadenas B-C, C'-C'', y F-G del dominio variable de cadena pesada.

Utilizando la estructura tridimensional de una proteína como ayuda para el diseño, se han aleatorizado restos aminoácidos localizados sobre la superficie de muchas proteínas utilizando la estructura central de la proteína como andamiaje. Los ejemplos de esta estrategia se describen o se reseñan en las siguientes referencias que se incorporan en la presente como referencia: Nygren, P.A., Uhlen, M., Curr. Opin. Stuctur. Biol. (1997) , 7:463-469; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., Grutter, M.G., Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. (2004) , 22:575-582; Vogt, M., Skerra, A., Chembiochem. (2004) , 5:191-199; documento US 6.562.617.

El principio básico de esta técnica se basa en la observación de que muchas proteínas tienen un núcleo central estable, formado por disposiciones específicas de elementos de la estructura secundaria, tales como láminas beta o alfa-hélices, que están interconectados por estructuras, tales como bucles, vueltas, o espirales aleatorias. Generalmente, estos últimos tres elementos de estructura son menos cruciales para la estructura global de la proteína, y a menudo pueden intercambiarse restos aminoácidos en estos elementos de estructura sin destruir el plegamiento general de la proteína. Un ejemplo natural de este principio de diseño son las CDR de los anticuerpos. Los ejemplos artificiales incluyen lipocalinas, anquirinas y otros andiamajes de proteínas.

Los bucles que no son bucles de CDR en una inmunoglobulina nativa no tienen especificidad de unión al antígeno o de unión al epitopo pero contribuyen al plegamiento correcto de la molécula de inmunoglobulina completa y/o a sus funciones efectoras o a otras funciones y, por tanto, se denominan bucles estructurales para el objetivo de esta invención.... [Seguir leyendo]

1. Un dominio variable de inmunoglobulina, o una parte de este, que comprende al menos una región de bucle estructural de un dominio variable de la cadena pesada o ligera de una inmunoglobulina, comprendiendo dicha al menos una región de bucle estructural al menos una modificación para proporcionar un sitio de unión que no es una CDR que se une a un epitopo de un antígeno, no uniéndose dicha región de bucle estructural no modificada a dicho epitopo, en el que dicha modificación comprende una mutagénesis en un bucle inferior seleccionado del grupo que consiste en los bucles que conectan las cadenas beta A-B, C-C', C''-D y E-F del dominio variable.

2. Una inmunoglobulina según la reivindicación 1, en la que dicha región de bucle modificada está en cualquiera de un dominio Vh o Vl.

3. Una inmunoglobulina según la reivindicación 1 o 2, en la que dicha región de bucle modificada está en la región C-terminal.

4. Una inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende un dominio bivalente o biespecífico.

5. Una inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un único dominio de inmunoglobulina o un Fv monocatenario.

6. Una inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con al menos dos regiones de bucles estructurales modificadas.

7. Una inmunoglobulina que comprende al menos una inmunoglobulina modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha región de bucle estructural modificada comprende al menos 6 modificaciones de aminoácidos.

8. Una molécula que comprende al menos una inmunoglobulina modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y al menos otra molécula de unión, en la que dicha otra molécula de unión se selecciona del grupo de inmunoglobulinas, receptores solubles, ligandos, ácidos nucleicos, y carbohidratos.

9. Una inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que se caracteriza porque dicha modificación está dentro de un dominio variable humano en una de las posiciones de los aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 44 a 50, los aminoácidos 67 a 76, y los aminoácidos 89 a 101, en la que la numeración de la posición de los aminoácidos de los dominios es la del IMGT.

10. Una inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que se caracteriza porque dicha modificación está dentro de un dominio variable murino en una de las posiciones de los aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 6 a 20, los aminoácidos 44 a 52, los aminoácidos 67 a 76, y los aminoácidos 92 a 101, en la que la numeración de la posición de los aminoácidos de los dominios es la del IMGT.

11. Una inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que tiene especificidad de unión por un antígeno seleccionado del grupo que consiste en alergenos, antígenos asociados a tumores, autoantígenos, enzimas, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos víricos y antígenos protozoarios.

12. Una inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que tiene especificidad de unión por FcRn.

13. Una inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que tiene especificidad de unión por una molécula efectora.

14. Una inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende una inmunoglobulina humana, humanizada, quimérica, murina o de camello, o sus homólogos.

15. Un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Una preparación farmacéutica que contiene una inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

Fig. 8

SEQ ID NO:1: Secuencia de aminoácidos del dominio CH3 del anticuerpo1ºqo.pdb

SEQ ID NO:2: Secuencia de nucleótidos del dominio CH3 modificado del ejemplo 1

SEQ ID NO:3: Secuencia de aminoácidos del dominio CH3 modificado del ejemplo 1

SEQ ID NO:4: Cebador de PCR CH3LNCO

SEQ ID NO:5: Cebador de PCR CH3LSAC

SEQ ID NO:6: Cebador de PCR CH3CSAC

Figura 8 continuación SEQ ID NO:7: Cebador de PCR CH3CHIN

SEQ ID NO:8: Cebador de PCR CH3RHIN

SEQ ID NO:9: Cebador de PCR CH3RNOT

SEQ ID NO:10: Secuencia de aminoácidos del dominio CH3+3 modificado SEQ ID NO:11: Secuencia de nucleótidos del dominio CH3+3 modificado SEQ ID NO:12: Cebador de PCR CH3RHIN3

SEQ ID NO:13: Secuencia de aminoácidos del dominio CH3+5 modificado Figura 8 continuación SEQ ID NO:14: Secuencia de nucleótidos del dominio CH3+5 modificado SEQ ID NO:15: Cebador de PCR CH3RHIN5

SEQ ID NO:16: Secuencia de aminoácidos del clon D07 anti-EpCAM

SEQ ID NO:17: Secuencia de nucleótidos del clon D07 anti-EpCAM

SEQ ID NO:18: Secuencia de aminoácidos del clon C67 anti-EpCAM

Figura 8 continuación SEQ ID NO:19: Secuencia de nucleótidos del clon C67 anti-EpCAM

SEQ ID NO:20: Secuencia de aminoácidos del clon D64C3 antifluoresceína SEQ ID NO:21: Secuencia de nucleótidos del clon D64C3 antifluoresceína SEQ ID NO:22: Secuencia de aminoácidos del clon A68 antilisozima SEQ ID NO:23: Secuencia de nucleótidos del clon A68 antilisozima Figura 8 continuación SEQ ID NO:24: Secuencia de aminoácidos del clon B23 antilisozima SEQ ID NO:25: Secuencia de nucleótidos del clon B23 antilisozima SEQ ID NO:26: Secuencia de aminoácidos del clon B40 antilisozima SEQ ID NO:27: Secuencia de nucleótidos del clon B40 antilisozima SEQ ID NO:28: Secuencia de aminoácidos del clon C24 antilisozima Figura 8 continuación SEQ ID NO:29: Secuencia de nucleótidos del clon C24 antilisozima SEQ ID NO:30: Secuencia de aminoácidos del clon D46 antilisozima SEQ ID NO:31: Secuencia de nucleótidos del clon D46 antilisozima SEQ ID NO:32: Secuencia de aminoácidos del clon D56 antilisozima SEQ ID NO:33: Secuencia de nucleótidos del clon D56 antilisozima Figura 8 continuación SEQ ID NO:34: Secuencia de aminoácidos del clon A23 anti-TLR9

SEQ ID NO:35: Secuencia de nucleótidos del clon A23 anti-TLR9

SEQ ID NO:36: Secuencia de aminoácidos del clon A33 anti-TLR9

SEQ ID NO:37: Secuencia de nucleótidos del clon A33 anti-TLR9

SEQ ID NO:38: Secuencia de aminoácidos del clon D2 anti-TLR9

Figura 8 continuación SEQ ID NO:39: Secuencia de nucleótidos del clon D2 anti-TLR9

SEQ ID NO:40: Secuencia de aminoácidos del clon D68 anti-TLR9

SEQ ID NO:41: Secuencia de nucleótidos del clon D68 anti-TLR9

SEQ ID NO:42: Secuencia de aminoácidos del dominio CH3 biespecífico, mutado en ambos lados, que se une a lisozima y a eritropoyetina, clon D72

Figura 8 continuación SEQ ID NO:43: Secuencia de nucleótidos del dominio CH3 biespecífico, mutado en ambos lados, que se une a lisozima y a eritropoyetina, clon D72

SEQ ID NO:44: Secuencia de aminoácidos de la construcción de tipo Fab bivalente, que consiste en VH y VL del anticuerpo 3D6 anti-gp41 de VIH-1 y clon C24 antilisozima (3D6-VH - C24)

SEQ ID NO:45: Secuencia de nucleótidos de la construcción de tipo Fab bivalente, que consiste en VH y VL del anticuerpo 3D6 anti-gp41 de VIH-1 y clon C24 antilisozima (3D6-VH - C24)

Figura 8 continuación SEQ ID NO:46: Secuencia de aminoácidos de la construcción de tipo Fab bivalente, que consiste en VH y VL del anticuerpo 3D6 anti-gp41 de VIH-1 y clon C24 antilisozima (3D6-VL - C24)

SEQ ID NO:47: Secuencia de nucleótidos de la construcción de tipo Fab bivalente, que consiste en VH y VL del anticuerpo 3D6 anti-gp41 de VIH-1 y clon C24 antilisozima (3D6-VL - C24)

SEQ ID NO:48: Secuencia de aminoácidos del banco de CL

SEQ ID NO:49: Secuencia de nucleótidos del banco de CL Figura 8 continuación SEQ ID NO:50: Secuencia de aminoácidos del banco de CL+3

SEQ ID NO:51: Secuencia de nucleótidos del banco de CL+3

SEQ ID NO:52: Secuencia de aminoácidos del banco de CL+5

SEQ ID NO:53: Secuencia de nucleótidos del banco de CL+5 Figura 8 continuación SEQ ID NO:54: Secuencia de aminoácidos del banco de CH

SEQ ID NO:55: Secuencia de nucleótidos del banco de CH