Fotoporación microfluídica.

Un sistema microfluídico de permeabilización celular para la permeabilización de una o más células en un flujo de fluido,

comprendiendo el sistema un canal microfluídico (16) para la canalización de al menos una célula en un flujo de fluido y una fuente óptica que genera un haz de luz para la permeabilización de al menos una célula, en donde canal microfluídico (16) comprende una parte de permeabilización (20), en la cual, en uso, las células se permeabilizan, que se caracteriza por que el canal (16) y la fuente están dispuestos de manera que, en uso, el haz de luz y el flujo de fluido son colineales en dicha parte de permeabilización (20) del canal (16).

Fotoporación microfluídica Campo de la invención

La presente invención se refiere a un sistema para la inyección de "agentes de inyección" que podrían incluir agentes químicos, material particulado (por ejemplo nanopartículas, puntos cuánticos) o agentes biológicos (por ejemplo, ADN, ARN, proteínas) en células biológicas, por medio del uso de un campo óptico para la permeabilización celular en conjunción con un flujo de fluido.

Antecedentes

El uso de un haz láser enfocado para crear un poro auto-cicatricial de un diámetro de sub-micrones en la membrana plasmática de una célula (fotoporación/optoporación), para la introducción selectiva de sustancias impermeables a la membrana (inyección óptica/optoinyección) que incluyen ácidos nucleicos (transfección óptica), es una técnica potente que se aplica mayoritariamente para tratar células únicas. La membrana de una célula sana es impenetrable a las grandes moléculas polares. La capacidad para superar esta barrera e inyectar un material ajeno, tal como ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARNm, ARN de interferencia, un tinte o un fármaco, por ejemplo, en una células biológica viva sin dañar la integridad de la células o el agente, es de interés para un amplio intervalo de aplicaciones en biología y medicina.

Existe una variada gama de métodos para permeabilizar la membrana de una célula para la inserción de material ajeno que incluye: la inserción de pipetas de tamaño micrón (microinyección); aplicación de campos eléctricos (electroporación); inserción balística de nanopartículas recubiertas (pistola genética); transporte de agentes terapéuticos encapsulados en partículas basadas en lípidos (lipofección) o polímeros; suministro vírico; formación de poros o permeabilización utilizando ondas acústicas (sonoporación); y utilizando campos de láser para abrir un poro transitorio en la membrana (fotoporación). De estos, la fotoporación ha demostrado satisfactoriamente en un amplio intervalo de tipos de células animales y vegetales y tiene muchas ventajas. Sin embargo, las estrategias de fotoporación hasta ahora se han limitado a los estudios de bajo rendimiento, a pequeña escala, ya que necesitan dosificación secuencial manual de células individuales.

Un sistema que empieza a afrontar el problema del rendimiento de la fotoporación se describe en Marchington et al. en Biomedical Optics Express 1, 2, 527 (21). Este sistema tiene un chip microfluídico que se utiliza para suministrar las células por medio de un haz de láser de femtosegundos enfocado para la fotoporación, lo que hace posible que las células se dirijan en una estrategia automática. El haz se enfoca a un punto de difracción limitada utilizando un objetivo de microscopio externo, y las células se pasan a través del foco en una dirección ortogonal a la dirección de propagación del láser. Haciendo esto se permite que se alcancen resultados de una célula por segundo. Sin embargo debido a la necesidad de que las células se expongan al haz 1-1 milisegundos, el rendimiento sigue siendo limitado.

Otro sistema que intenta afrontar el problema del rendimiento en la fotoporación se describe por Marchington Marchington et al in Conference on Lasers and Electo-Optics (CLEO) and Quantum Electronics and Láser Science Conference (QELS) 16 May 21. El sistema tiene un chip microfluídico. En el chip, los pulsos de femtosegundos enfocados con precisión se combinan con el enfoque hidrodinámico para proporcionar un suministro continuo de células al haz láser para la inyección óptica. Se abre un agujero transitorio en la membrana según pasa a través.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un sistema de permeabilización celular microfluídica para permeabilizar una o más células en un flujo de fluido de acuerdo con la reivindicación 1, estando descritas las realizaciones preferidas por las reivindicaciones dependientes 2 a 13. La invención también proporciona un método para permeabilizar una o más células de acuerdo con la reivindicación 14, y preferentemente de acuerdo con la reivindicación 15.

Debido a que el haz de luz y el flujo de fluido son colineales, la dosis de láser necesaria para la fotoporación se puede extender a lo largo de toda la longitud de interacción del campo del láser en vez de estar confinado a un pequeño volumen de interacción. Esto permite un aumento de la tasa de flujo del fluido y por tanto del rendimiento. Una ventaja más es que las células se pueden pasar secuencialmente a través del campo de luz para la poración continua. Esto se puede llevar a cabo en una manera automática de alto rendimiento para la inyección de un gran número de células, con las altas eficacias y viabilidades tras la inyección que son posibles utilizando la fotoporación.

El sistema microfluídico puede tener medios para guiar las células en una región de confinamiento contenida en el flujo de fluido en la parte de permeabilización. Preferentemente, los medios de guía de células se basan en enfoque hidrodinámico. Los medios de guía celular pueden comprender una boquilla tridimensional. El haz de luz puede extenderse sobre un volumen que incluye la región de confinamiento.

Preferentemente, el canal de fluido tiene un "codo en L" o una "curva en S" o una "curva en U", y la fuente óptica se posiciona en la curva.

El canal y la fuente óptica se pueden disponer de forma que el haz de luz sea paralelo a las paredes del canal.

El canal y la fuente óptica ser pueden disponer de forma que en la parte de permeabilización del flujo celular se mueva en una dirección opuesta a la dirección de propagación del haz de luz.

El sistema de microfluídico puede tener medios de variación del perfil de intensidad del haz lumínico. Tales medios pueden incluir una lente axicon y/o un modulador espacial de luz. Los medios de variación del perfil de intensidad del haz lumínico se pueden utilizar para generar un haz de luz no difractante tal como un haz de Bessel. Preferentemente el haz de Bessel una propagación sin variación a lo largo de la longitud de la parte de permeabilización del canal. Debido a esta propagación extendida sin variación del punto focal, el haz de Bessel se puede posicionar a lo largo de la longitud de la curva en S, para una tasa de flujo de fotoporación. El núcleo central del haz de Bessel se repara por sí mismo alrededor de una obstrucción. Esto significa que se pueden porarse / permeabilizarse multitud de células en el flujo simultáneamente (en que cualquier célula alineada con el núcleo central se considera una obstrucción).

El sistema de microfluídico puede tener una o más entradas que se proporcionan para introducir uno o más fluidos adicionales en el canal de microfluídico. La una o más entradas se pueden posicionar para permitir que se introduzcan uno o más fluidos adicionales en el canal de microfluídico antes del canal de permeabilización.

La luz puede acoplarse en al canal de permeabilización utilizando una fibra óptica o una guía de onda.

El canal puede tener una sección cruzada cuadrada o una sección cruzada circular o una sección cruzada rectangular. El canal puede tener dimensiones seccionales cruzadas en el intervalo de 1-5 pm, por ejemplo, 1- 5 pm, opcionalmente 5-1 pm. El canal de microfluídico y/o la fuente óptica se pueden formar en el chip, formando un dispositivo integrado en el chip.

La fuente óptica se puede disponer para proporcionar un haz de luz que es tal que la función celular se conserva después de la permeabilización.

Como ejemplos no limitantes, el sistema se puede utilizar para permear membranas de células biológicas (animales, vegetales o fúngicas), bacterias, secciones de tejido o células múltiples unidas, organismos vivos multicelulares microscópicos, vesículas extracelulares (p9or ejemplo, exosomas), orgánulos subcelulares (por ejemplo, mitocondrias, núcleos, cloroplastos, endosomas, vesículas), lípidos y micelas artificiales, gotículas lipídicas, y versiones artificiales o modificadas de cualquiera de estas partículas enumeradas. El intervalo de tamaños de las partículas que se podrían permear podría variar dese 1 nanómetros a 1 milímetro.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para permeabilizar una o más células en un flujo de fluido que comprende la exposición de las células del fluido a un haz de luz que es colineal con la dirección del flujo de fluido. Preferentemente, el haz de luz es un haz de Bessel.

El método puede comprender la introducción de uno o más fluidos adicionales en el flujo de fluido antes de la exposición lumínica.

Breve descripción de los dibujos

1. Un sistema microfluídico de permeabilización celular para la permeabilización de una o más células en un flujo de fluido, comprendiendo el sistema un canal microfluídico (16) para la canalización de al menos una célula en un flujo de fluido y una fuente óptica que genera un haz de luz para la permeabilización de al menos una célula, en donde canal microfluídico (16) comprende una parte de permeabilización (2), en la cual, en uso, las células se permeabilizan, que se caracteriza por que el canal (16) y la fuente están dispuestos de manera que, en uso, el haz de luz y el flujo de fluido son colineales en dicha parte de permeabilización (2) del canal (16).

2. Un sistema microfluídico de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende medios de dirección de células para dirigir las células a una región de confinamiento contenida en el flujo de fluido en la parte de permeabilización (2).

3. Un sistema microfluídico de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los medios de dirección de las células se basan en el enfoque hidrodinámico y/o los medios de dirección celular comprenden una boquilla tridimensional.

4. Un sistema microfluídico de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que el haz de luz se extiende sobre un volumen que incluye la región de confinamiento.

5. Un sistema microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el canal de fluido (16) tiene una curva y el haz de luz se acopla al canal (16) en la curva.

6. Un sistema microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el canal de fluido (16) tiene "forma de L" o "forma de S" o "forma de U".

7. Un sistema microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el canal (16) y la fuente óptica están dispuestos de tal manera que, en la parte de permeabilización (2), el flujo celular se mueve en una dirección opuesta a la de propagación del haz de luz.

8. Un sistema microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende medios para variar el perfil de intensidad del haz de luz.

9. Un sistema microfluídico de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el medio de variación del perfil de intensidad de luz incluye lentes axicon (22) y/o un modulador espacial de luz.

1. Un sistema microfluídico de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que los medios de variación del perfil de intensidad del haz de luz son operables para generar un haz de luz no difractante.

11. Un sistema microfluídico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el haz de luz no difractante es un haz de Bessel que es invariante en su propagación a lo largo de la longitud de la parte de permeabilización (2) del canal (16).

12. Un sistema microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se proporcionan una o más entradas (25, 26) para introducir uno o más fluidos adicionales en el canal microfluídico (16).

13. Un sistema microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el canal microfluídico (16) y la fuente óptica están internos en el chip formando un dispositivo interno en el chip integrado.

14. Un método de permeabilización de una o más células en un flujo de fluido en un sistema microfluídico que se caracteriza por que dicho método comprende la exposición de las células en un fluido a un haz de luz que es colineal con la dirección del flujo de fluido.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en que el haz de luz es un haz de Bessel.