Ensayo para detección de Xanthomonas axonopodis pv. allii.

Uso de un polinucleótido aislado, susceptible de obtención a partir de Xanthomonas axonopodis pv.

allii, definido con la secuencia SEC ID Nº: 6 para la detección de Xanthomonas axonopodis pv. allii.

Ensayo para detección de Xanthomonas axonopodis pv. allii

La presente invención se refiere a nuevas herramientas de detección de Xanthomonas axonopodis pv. allii.

Xanthomonas axonopodis pv. allii es el agente causal del debilitamiento bacteriano de la cebolla, una de las principales limitaciones sanitarias del cultivo de las aliáceas. Esta enfermedad se observó por primera vez en 1971 en Barbados (Antillas), después, en 1975, en varias islas del archipiélago de Hawai. En la década de 198 esta bacteria se encontró en Brasil, Cuba e isla Mauricio. De 199 a 2, llegó a Estados Unidos, Venezuela, Sudáfrica y Japón, provocando daños importantes. Xanthomonas axonopodis pv. allii se caracterizó por primera vez en Hawai en 1978 (Alvarez y col., Physiopathology ; 68 : 1132-1136, 1978).

Xanthomonas axonopodis pv. allii es patógeno de las aliáceas, en particular del ajo, puerro, cebolleta, chalota y cebolla (Roumagnac y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 54: 15-24, 24), tendiendo la enfermedad a ser más grave en la cebolla. Esta bacteria también se ha revelado como patógeno para especies del género Citrus durante infecciones experimentales por infiltración (Gent y col., Phytopathology, 95 (8): 918-925, 25); por lo tanto, no hay ninguna prueba que muestre que esta bacteria es patógena en el campo para el género Citrus.

Xanthomonas axonopodis pv. allii provoca en la cebolla lesiones en los tejidos aéreos de la planta (hojas y tallos florales), caracterizadas por la presencia de pequeñas manchas acuosas lenticulares que se extienden y evolucionan rápidamente en clorosis y después necrosis. La enfermedad se ve favorecida por las temperaturas elevadas (superiores a 27 °C) y los principales focos aparecen rápidamente (de 7 a 1 días) después de un periodo de tiempo húmedo y lluvioso. A causa de la reducción del follaje, las plantas se atrofian y los bulbos disminuyen de tamaño, lo que da como resultado pérdidas de rendimiento importante, del orden de un 1 a un 5 %. Por ejemplo, en Estados Unidos, normalmente se observan pérdidas de rendimiento de un 2 %, o superior, en los campos infectados.

Se ha mostrado que la bacteria podía estar presente en las semillas de cebollas (Roumagnac y col., Eur. J. Plant Pathol., 16: 867-877, 2), que la enfermedad se podía difundir a gran escala, en particular por los intercambios comerciales de semillas, y que 4 semillas infectadas sobre 1 era suficiente para desencadenar una epidemia (Roumagnac y col., Phytophatology, 94: 138-146, 24).

Dentro de los cultivos, el viento y el riego, en particular el riego por aspersión, pueden asegurar una diseminación mayor de la enfermedad, como también es el caso con las tormentas y el granizo. Además, la bacteria es capaz de sobrevivir en los restos de los cultivos que a continuación se diseminan mediante la adhesión a la ropa y a los equipos de los trabajadores.

Debido a la importancia de las epidemias, y a la baja proporción de semillas contaminadas necesarias para desencadenar las consiguientes epidemias, esta bacteria se ha puesto en la lista de alerta de la Organización Europea de Protección de Plantas (OEPP) en 26. Un procedimiento está en marcha para su inclusión en la lista A1 de organismos en cuarentena de la OEPP.

Están disponibles medidas de lucha contra el debilitamiento bacteriano de la cebolla, por ejemplo, uso de semillas sanas, destrucción de rebrotes de cebollas, destrucción de restos vegetales, rotaciones, control químico.

Además, las comercializaciones y los intercambios internacionales de semillas son los agentes principales de la propagación de esta enfermedad y representan un riesgo de introducción del agente patógeno en zonas sanas por la introducción de nuevos genotipos en zonas ya contaminadas. Por lo tanto, es necesario poder garantizar la buena calidad sanitaria de estas semillas. Para ello, son indispensables ensayos de diagnóstico de rutina rápidos, fiables y sensibles que permitan la certificación de los lotes de semillas de Allium. En la actualidad, no existen tales herramientas de diagnóstico. Los procedimientos de identificación usados en la actualidad se basan en el aislamiento de la bacteria a partir del material vegetal infectado y su puesta en cultivo sobre un medio apropiado, en particular el medio NCTM1 (Roumagnac y col., Eur. J. Plant Pathol., 16: 867-877, 2). El aislamiento de la bacteria necesita varios días, y la identidad de la bacteria se debe verificar de inmediato con procedimientos bioquímicos, tipificaciones moleculares y/o ensayos de patogenicidad (Gent y col., Phytopathology, 94 (2): 184-195, 24; Picard y col., Phytopathology, 98 (9): 919-925, 28). Además, la presencia de otras bacterias en las muestras puede disminuir en ciertos casos la sensibilidad del ensayo y provocar la detección de falsos positivos.

Se ha desarrollado un ensayo de identificación por amplificación con PCR de una secuencia específica de Xanthomonas axonopodis pv. allii (Humeau y col., Phytopathology, 96 (12): 1345-1354, 26; Picard y col., Phytopathology, 98 (9) : 919-925, 28). Este ensayo consiste en realizar una PCR anidada usando, durante una primera etapa, los cebadores PXaalU (SEC ID N°: 1) / PXaalL (SEC ID N°: 2), después en una segunda etapa los cebadores NXaal U (SEC ID N°: 3) / NXaal L (SEC ID N°: 4). Sin embargo, aunque este procedimiento es sensible y fiable, no permite la detección de todas las cepas, en particular las que provienen de Barbados y de Brasil. La falta de detección de determinadas cepas se explicaría por la gran diversidad genética intrapatovar de Xanthomonas axonopodis pv. allii (Picard y col., Phytopathology, 98 (9): 919-925, 28; Gent y col., Phytopathology, 94 (2): 184- 195, 24; Gent y col., Phytopathology, 95 (8): 918-925, 25). Además, un estudio de diversidad genética mostró

que el polimorfismo de las cepas era variable según su origen geográfico: existen zonas con una gran diversidad (en particular Estados Unidos, Sudáfrica) y zonas con una diversidad escasa (por ejemplo Venezuela, Hawai, Barbados).

En consecuencia, dado que en la actualidad no existe ningún ensayo disponible para detectar el conjunto de cepas de Xanthomonas axonopodis pv. allii, es indispensable el desarrollo de una herramienta de diagnóstico fiable, sensible y que permita la detección de todas las cepas, independientemente de su origen geográfico, para optimizar la lucha contra las enfermedades provocadas por esta bacteria y para mejorar la vigilancia sanitaria durante los intercambios internacionales.

Los Inventores han identificado ahora dos secuencias de ADN diana específicas de Xanthomonas axonopodis pv. allii. Estas secuencias diana, denominadas « PIL » y « AVR », se representan en el listado de secuencias adjunto con los números SEC ID N°: 5 y SEC ID N°: 6, respectivamente.

El marcador PIL, puesto en evidencia por la técnica de amplificación aleatoria de ADN polimorfo, o RAPD para « Amplificación Aleatoria de ADN Polimórfico », está presente en aproximadamente un 7 % de las cepas de Xanthomonas axonopodis pv. allii. Se ha comprobado que los cebadores PXaalU (SEC ID N°: 1) / PXaalL (SEC ID N°: 2) y NXaalU (SEC ID N°: 3) / NXaalL (SEC ID N°: 4) usados por Humeau y col. (Phytopathology, 96: 1345- 1354, 26) se hibridaban a esta secuencia diana.

El marcador « AVR », identificado por el procedimiento AFLP (para Polimorfismo de Longitud de Fragmento Amplificado), está al menos presente en todas las cepas que no poseen el marcador« PIL ».

Por lo tanto, debido a la complementariedad de estos marcadores, su búsqueda conjunta permite el diagnóstico selectivo del conjunto de cepas conocidas de Xanthomonas axonopodis pv. allii.

Por lo tanto, la presente invención tiene como objeto el uso de un polinucleótido aislado, para la detección de Xanthomonas axonopodis pv. allii, este polinucleótido aislado, susceptible de obtención a partir de Xanthomonas axonopodis pv. allii, se define con la secuencia SEC ID N°: 6 y se elige entre el grupo constituido por:

a) el polinucleótido de secuencia SEC ID N°: 6;

b) un polinucleótido que tiene un 85 %, preferentemente un 9 %, y más preferentemente un 95 % de identidad con la secuencia SEC ID N°: 6;

c) cualquier fragmento de al menos 15 pb de dicho polinucleótido;

d) cualquier polinucleótido complementario de uno de los polinucleótidos a) o b);

e) cualquier polinucleótido capaz de hibridarse selectivamente, en condiciones rigurosas con uno de los polinucleótidos a), b), c) o d).

Los porcentajes de identidad a los que se hace referencia como parte de la presentación de la presente invención se determina en una alineación global de las secuencias a comparar, usando el algoritmo de NEEDLEMAN y WUNSCH (J. Mol. Biol.... [Seguir leyendo]

1. Uso de un polinucleótido aislado, susceptible de obtención a partir de Xanthomonas axonopodis pv. allii, definido con la secuencia SEC ID N°: 6 para la detección de Xanthomonas axonopodis pv. allii.

2. Procedimiento de cribado de Xanthomonas axonopodis pv. allii, caracterizado porque comprende:

- poner en presencia de ADN una muestra biológica susceptible de contener dicha bacteria con uno o varios polinucleótidos de acuerdo con la invención, en condiciones que permitan una hibridación selectiva entre dicho o dichos polinucleótidos y la secuencia diana SEC ID N°: 6, si ésta está presente en dicho ADN;

- detectar dicha hibridación.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende las etapas siguientes :

i) poner en presencia de ADN una muestra biológica a someter a ensayo con un par de cebadores de acuerdo con la invención, en condiciones que permiten una hibridación selectiva entre los cebadores y la secuencia diana SEC ID N°: 6 ;

ii) realizar una reacción de amplificación en cadena de la polimerasa en condiciones que permitan la amplificación de la secuencia diana SEC ID N°: 6;

iii) detectar el producto de amplificación.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende además una etapa iv) que es una amplificación en cadena de la polimerasa con la ayuda de un segundo par de cebadores que permiten la amplificación de un fragmento interno del producto de amplificación de la etapa ii).

5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el ADN de la muestra se pone además en presencia de al menos un polinucleótido capaz de hibridarse selectivamente, en condiciones rigurosas, con la secuencia diana SEC ID N°: 5.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, caracterizado porque, en la etapa i), el ADN de la muestra se pone además en presencia de uno o varios polinucleótidos capaces de hibridarse selectivamente, en condiciones rigurosas, con la secuencia diana SEC ID N° : 5, y porque las condiciones de la etapa ii) permiten, además de la amplificación de la secuencia diana SEC ID N°: 6, la amplificación de la secuencia diana SEC ID N°: 5.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa de amplificación iv) se realiza además en presencia de un par de cebadores que permiten la amplificación de un fragmento interno del producto de amplificación de la primera etapa de amplificación del polinucleótido de secuencia SEC ID N°: 5.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la etapa de amplificación ii) se realiza con el par de cebadores PXaalU (SEC ID N°: 1) y PXaal L (SEC ID N°: 2) y el par de cebadores PXaa2U (SEC ID N°: 7) y PXaa2L (SEC ID N°: 8), y porque la etapa de amplificación iv) se realiza con el par de cebadores NXaalU (SEC ID N°: 3) y NXaalL (SEC ID N°: 4) y el par de cebadores NXaa2U (SEC ID N°: 9) y NXaa2L (SEC ID N°: 1).

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizado porque la muestra biológica es una semilla de aliácea.

1. Kit de detección de Xanthomonas axonopodis pv. allii, caracterizado porque comprende uno o varios polinucleótidos capaces de hibridarse selectivamente, en condiciones rigurosas, con la secuencia diana SEC ID N°: 6 y uno o varios polinucleótidos capaces de hibridarse selectivamente, en condiciones rigurosas, con la secuencia diana SEC ID N°: 5.

11. Kit de detección de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende los pares de cebadores de amplificación siguientes:

- el par de cebadores constituido por los polinucleótidos PXaal U (SEC ID N°: 1) y PXaal L (SEC ID N°: 2);

- el par de cebadores constituido por los polinucleótidos NXaal U (SEC ID N°: 3) y NXaal L (SEC ID N°: 4);

- el par de cebadores constituido por los polinucleótidos PXaa2U (SEC ID N°: 7) y PXaa2L (SEC ID N°: 8); y

- el par de cebadores constituido por los polinucleótidos NXaa2U (SEC ID N°: 9) y NXaa2L (SEC ID N°: 1).