Ensayo homogéneo basado en la polarización de la fluorescencia para la determinación de desoxinivalenol en granos.

Un trazador para utilizar en un ensayo homogéneo para la determinación de desoxinivalenol (DON) en granos,

donde el trazador consiste en un fluoróforo conjugado a DON, capaz de unirse a un anticuerpo específico contra DON para producir un cambio detectable en la polarización de la fluorescencia.

Ensayo homogéneo basado en la polarización de la fluorescencia para la determinación de desoxlnivalenol en granos

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

Esta Invención se refiere al campo de los ensayos de micotoxinas. Más particularmente, esta invención se refiere a un ensayo homogéneo que utiliza cambios en la polarización de la fluorescencia para detectar la presencia de desoxinivalenol en granos.

2. Descripción del área relacionada

El desoxinivalenol (DON), que también se conoce como vomitoxina, es una micotoxlna producida en diversos granos, como trigo, maíz, cebada, avena y centeno, por el Fusarium graminearum y otras cepas de Fusarium1-4 La presencia de DON en los alimentos provoca rechazo a los alimentos, vómitos y depresión del crecimiento en suinos, enfermedad gastrointestinal en los seres humanos y embriotoxicidad e inmunotoxicidad en animales de laboratorio1" 4 Debido a los riesgos de salud latentes, se están llevando a cabo investigaciones para explorar métodos analíticos de detección del DON.

Más en general, DON es una micotoxina particularmente problemática dentro del grupo de las micotoxinas conocidas como tricotecenos. Como se muestra en la figura 1, los tricotecenos tienen un esqueleto común que puede tener diferentes grupos unidos en R1-R5. La figura 2 identifica los grupos R1-R5 de la figura 1 para DON y para algunos de los otros tricotecenos más conocidos.

Se utilizan diversos métodos para el análisis cuantitativo de DON y otros tricotecenos en granos, como cromatografía en capa delgada (TLC), cromatografía de gases (GC) y cromatografía líquida de alta presión (HPLC). El método de TLC es un método oficial (primera acción) de la AOAC internacional. Aunque es relativamente simple, el método de TLC carece de sensibilidad y es sólo semicuantitativo. Además, la mayoría de estos métodos cromatográficos requiere procedimientos de limpieza minuciosos después de la extracción y no es adecuado para el análisis de campo4,5.

Recientemente, se han aplicado con éxito métodos de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) a la detección sistemática de DON en granos2. Sin embargo, los métodos de ELISA implican indeseablemente un uso intensivo de mano de obra, dado que normalmente comprenden varios lavados, transferencias de líquidos y tiempos de incubación. Por lo tanto, existe la necesidad de un método simple, pero sensible, para la determinación de DON y otros tricotecenos en granos que sea rápido y se pueda llevar al campo.

En Nielsen, K. et al., "A homogeneous fluorescence polarizaron assay for detection of antibody to Brucella abortus", Journal of Immunological Methods, 1996, 195, 161-168, se describe un ensayo homogéneo de polarización de la fluorescencia para la detección de anticuerpos contra Brucella abartus en suero bovino. En Ligler, F.S. et al., "A Homogeneous Immunoassay for the Mycotoxin T-2 Utilizing Liposomes, Monoclonal Antibodies, and Complement", Analytical Biochemishy, 1987, 163, 369-375, se describe un ensayo de competición homogéneo para la micotoxina tricoteceno T-2 basado en la lisis de liposomas mediada por complemento. En Adamczyk, M. et al., "Synthesis of Conjugates for a Barbiturate Screening Assay", Bioconjugate Chem., 1997, 8, 281-288 se describen derivados de barbituratos y su uso para desarrollar un inmunoensayo de polarización de la fluorescencia.

Resumen de la invención

En un primer aspecto principal, la presente invención proporciona un trazador para utilizar en un ensayo homogéneo para la determinación de desoxinivalenol (DON) en granos, donde el trazador consiste en un fluoróforo conjugado a DON, capaz de unirse a un anticuerpo específico contra DON para producir un cambio detectable en la polarización de la fluorescencia.

En un segundo aspecto principal, la presente Invención proporciona un ensayo homogéneo para la determinación de tricotecenos en granos. Según el método, el tricoteceno se extrae de una muestra de grano. El extracto se combina con un trazador y un anticuerpo para proporcionar una mezcla. El trazador consiste en un tricoteceno predeterminado conjugado a un fluoróforo y el trazador es capaz de unirse al anticuerpo para producir un cambio detectable en la polarización de la fluorescencia. Después se mide la polarización de la fluorescencia de la mezcla. La polarización de la fluorescencia medida se compara con un valor de polarización de la fluorescencia caracterizado que corresponde a una concentración conocida de tricoteceno.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la estructura química básica de los tricotecenos, con R1, R2, R3, R4 y R5 que representan posiciones de sustitución en el esqueleto básico de los tricotecenos.

La figura 2 es una tabla de identificación de los grupos R1-R5 de la figura 1 para algunos tricotecenos muy conocidos.

La figura 3 es una curva estándar para un ensayo de polarización de la fluorescencia para DON, que utiliza los datos de la tabla 1, de conformidad con una realización preferida de la presente invención.

La figura 4 es una curva estándar para un ensayo de polarización de la fluorescencia para DON, que utiliza los datos de la tabla 2, de conformidad con una realización preferida de la presente invención.

La figura 5 es una curva estándar para un ensayo de polarización de la fluorescencia para DON, que utiliza los datos de la tabla 3, de conformidad con una realización preferida de la presente invención.

La figura 6 es una gráfica que compara la concentración de DON de muestras inoculadas con la concentración de DON calculada a partir de la curva estándar de la figura 5, de conformidad con una realización preferida de la presente invención.

La figura 7 es una curva estándar para un ensayo de polarización de la fluorescencia para DON, que utiliza los datos de la tabla 5, de conformidad con una realización preferida de la presente invención.

La figura 8 es una gráfica que compara la concentración de DON medida por HPLC con la concentración de DON calculada a partir de la curva estándar de la figura 7, de conformidad con una realización preferida de la presente invención.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención describe un ensayo homogéneo para la determinación de tricotecenos como DON en granos, que se basa en mediciones de polarización de la fluorescencia. La técnica de polarización de la fluorescencia se ha utilizado con éxito en varios ensayos relacionados con proteínas, enzimas, medicamentos, drogas de abuso, ADN, hormonas, péptidos y anticuerpos6'8.

El principio detrás de la técnica de polarización de la fluorescencia es el siguiente. Las sondas fluorescentes que tienen bajo peso molecular tienen valores de polarización bajos debido a su rápida rotación, mientras que las sondas fluorescentes con mayor peso molecular tienen un valor de polarización más alto debido a su rotación más lenta. Por consiguiente, el valor de polarización de un fluoróforo aumenta al unirse a una molécula más grande. Más información acerca de la técnica de polarización de la fluorescencia se proporciona en las patentes de Estados Unidos N° 5,427,960 y 5,976,820 y en Nasir, M. S. y Jolley, M. E., "Fluorescence Polarization: An analytical tool for Immunoassay and Drug Discovery," Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 1999, 2, 177-190.

El ensayo utiliza un trazador, que consiste en un fluoróforo conjugado a DON, que proporciona un valor de polarización especificado y es capaz de unirse a un anticuerpo específico contra DON para producir un cambio detectable en la polarización de la fluorescencia. Este trazador DON-fluoróforo compite con el DON libre de los extractos de granos por la unión a un anticuerpo específico (un ensayo de inhibición), que da lugar a un valor de polarización de la fluorescencia que es inversamente proporcional a la cantidad de DON en el grano.

En realizaciones preferidas, el ensayo es rápido, simple (en cuanto a que se requiere un entrenamiento mínimo) y se puede llevar al campo, por lo que es útil para la determinación de rutina y cuantitativa de DON en granos. El ensayo preferido también puede detectar cantidades muy pequeñas de DON (< 0.2 ppm).

1. Materiales y métodos

Todos los productos químicos y solventes se utilizaron como se recibieron a menos que se indique lo contrario. DON y fluoresceinamina (isómero II) se obtuvieron de Sigma. Los anticuerpos monoclonales específicos contra DON fueron provistos por el Dr. Chris Maragos (USDA, Peoria, IL). Las mezclas de reacción se separaron en TLC preparativa usando placas de gel de sílice (Sigma). La polarización de la fluorescencia... [Seguir leyendo]

1. Un trazador para utilizar en un ensayo homogéneo para la determinación de desoxinivalenol (DON) en granos, donde el trazador consiste en un fluoróforo conjugado a DON, capaz de unirse a un anticuerpo especifico contra DON para producir un cambio detectable en la polarización de la fluorescencia.

2. El rastreador de la reivindicación 1, en el cual el fluoróforo es 6-aminofluoresceína.

3. El rastreador de la reivindicación 1, en el cual el anticuerpo específico contra DON es un anticuerpo monoclonal.

4. Un ensayo homogéneo para la determinación de tricotecenos en granos, donde dicho ensayo homogéneo comprende los pasos de:

extraer tricoteceno de una muestra de grano para proporcionar un extracto;

combinar dicho extracto con un trazador y un anticuerpo para proporcionar una mezcla, donde dicho trazador consiste en un tricoteceno predeterminado conjugado a un fluoróforo y es capaz de unirse a dicho anticuerpo para producir un cambio detectable en la polarización de la fluorescencia; medir la polarización de la fluorescencia de dicha mezcla para obtener una medida de la polarización de la fluorescencia; y

comparar dicha medida de la polarización de la fluorescencia con un valor caracterizado de polarización de la fluorescencia, donde dicho valor caracterizado de polarización de la fluorescencia corresponde a una concentración conocida de tricoteceno.

5. El ensayo de la reivindicación 4, en el cual dicho tricoteceno predeterminado es el de desoxinivalenol (DON).

6. El ensayo de la reivindicación 5, en el cual dicho fluoróforo es 6-aminofluorescelna.

7. El ensayo de la reivindicación 4, que comprende además los pasos de:

proporcionar una pluralidad de soluciones estándar de tricoteceno, donde cada una de dichas soluciones estándar de tricoteceno tiene una concentración conocida diferente de tricoteceno;

agregar dicho trazador y dicho anticuerpo a cada una de dicha pluralidad de soluciones estándar de tricoteceno de modo de proporcionar una pluralidad de mezclas estándar; y

medir la polarización de la fluorescencia de cada una de dicha pluralidad de mezclas estándar para proporcionar una pluralidad de valores de polarización de la fluorescencia estándar correspondientes a concentraciones de tricoteceno conocidas.

8. El ensayo de la reivindicación 7, donde dicho valor de polarización de la fluorescencia caracterizado es uno de dichos valores de polarización de la fluorescencia estándar.