Ensayo de liberación de neuropéptido para canales de sodio.

Un método para identificar un antagonista de Nav1.7, que comprende:

(a) proporcionar ex vivo una célula que expresa una proteína de subunidad-a de Nav1.7 humano de longitud completa, o una proteína de subunidad-a de Nav1.7 quimérico que comprende un bucle extracelular de los dominios I o III de la subunidad-a de Nav1.7 de ratón que se ha remplazado por el correspondiente bucle de una subunidad-a de Nav1.7 humano;

(b) poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo que se une a, o bloquea una función de, la proteína de subunidad-a de Nav1.7 humano o de la proteína de subunidad-a de Nav1.7 quimérico de (a) y esperar un primer periodo de tiempo;

(c) poner en contacto la célula de (b) con uno o más mediadores inflamatorios y esperar un segundo periodo de tiempo;

(d) determinar la cantidad de péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) liberado de la célula después de la etapa (c); y

(e) comparar la cantidad de CGRP liberado en la etapa (d) con la cantidad de CGRP liberado en presencia de un inhibidor conocido de canales de sodio, en donde un aumento en CGRP liberado en presencia de un compuesto de ensayo indica inhibición de Nav1.7.

Ensayo de liberación de neuropéptido para canales de sodio

Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional de Estados Unidos N2 61/485.488, presentada el 12 de mayo de 2011, la solicitud de Estados Unidos N2 de serie 13/155.491, presentada el 08 de junio de 2011, y la solicitud de Estados Unidos N2 de serie 13/236.117 presentada el 19 septiembre de 2011; cada solicitud se incorpora específicamente en este documento por referencia en su totalidad.

Campo de la invención

Se proporcionan animales no humanos genéticamente modificados que expresan canales humanos de sodio abiertos por voltaje (Nav) o fragmentos de los mismos, en particular Nav1.7 (Scn9A). Se proporcionan ratones modificados genéticamente útiles para la identificación y ensayo de antagonistas para el tratamiento de patologías o trastornos de dolor crónico asociados con actividad y/o función aberrante de Nav1.7. Se proporcionan métodos para preparar animales no humanos modificados genéticamente que expresan proteína Nav1.7 humana y, como alternativa, que expresan una proteína Nav1.7 parcialmente humana. Se proporcionan animales no humanos que no expresan una proteína Nav1.7 endógena.

Antecedentes

Los canales de sodio son proteínas integrales de membrana que forman canales de iones en la membrana plasmática de células excitables. Se clasifican como canales de sodio abiertos por voltaje (Nav), que permiten el flujo de entrada de iones Na+ que median los potenciales de acción en células excitables; y canales de sodio abiertos por ligando, que se unen a ligando que desencadena el flujo de entrada de iones que conduce a potenciales de acción similares.

Los canales Nav, como los canales de calcio y potasio, están compuestos por una subunidad-a muy grande y compleja en la superficie de la célula que incluye cuatro dominios (DI-DIV), cada uno con seis segmentos de hélice- a transmembrana (S1-S6) e incluyendo un poro que permite el flujo de entrada de iones Na+ a la célula (FIG. 1; véase también Clare 2010 Expert Opin. Investig. Drugs 19(1): 45-62). Para canales Nav, un único gen codifica todos estos dominios. El segmento transmembrana 4 (S4) dentro de cada dominio de los canales Nav contiene aminoácidos cargados positivamente (FIG. 1) que actúan como sensor de voltaje. El bucle intracelular que conecta los dominios III y IV contiene secuencias que están aparentemente implicadas en la inactivación. Los canales Nav interaccionan con otras proteínas sobre la superficie celular llamadas subunidades-(5, que están implicadas en la cinética del canal y las funciones de abertura dependiente de voltaje. Los canales Nav muestran aparentemente diversas propiedades funcionales y distintos patrones de expresión, que implican funciones especializadas entre los canales y predispone a algunos para tareas en la transmisión de señales específicas, por ejemplo, señales de dolor.

A pesar de los muchos esfuerzos por dilucidar las propiedades y funciones de canales Nav humanos, el gran tamaño y naturaleza compleja de su estructura hace difícil estudiar los aspectos globales de su actividad biológica y su implicación en la respuesta del dolor. Esta dificultad está aumentada por el hecho de que la deleción global es letal; crías Scn9A'A mueren poco después de nacer, aparentemente debido a un fallo en la alimentación. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de composiciones y métodos que suplementen y potencien los actuales sistemas in vitro (por ejemplo, células transfectadas in vitro que contienen construcciones que expresan canales Nav humanos en cultivo) empleando enfoques más sensibles biológicamente para preparar animales no humanos y células que incluyan canales Nav humanos completos o canales Nav quiméricos que contengan fragmentos humanos específicos asociados con la activación del canal Nav y que puedan funcionar facilitando la respuesta del dolor.

Sumario de la invención

Se proporcionan animales no humanos, tejidos, y células modificadas por ingeniería genética que expresan una subunidad-a de Nav humano, o un fragmento funcional de la misma, sobre la superficie de una célula. En diversas realizaciones, la subunidad-a de Nav es una subunidad-a de Nav1.7.

En un aspecto, se proporcionan animales no humanos modificados por ingeniería genérica que expresan una subunidad-a de Nav1.7 sobre la superficie de una célula proporcionando un sistema in vivo para identificar antagonistas del canal, y para identificar agentes terapéuticos para el tratamiento de trastornos o síndromes de dolor, tales como, por ejemplo, dolor crónico, eritromelalgia (IEM) y trastorno de dolor extremo paroxístico (PEPD).

En un aspecto, se proporcionan animales no humanos modificados por ingeniería genética que expresan una subunidad-a de Nav1.7 sobre la superficie de una célula y proporcionan un sistema para ensayar de forma selectiva la eficacia y toxicidad de un agente terapéutico sobre formas mutantes o variantes de Nav1.7 humano. En una realización, el agente terapéutico es un compuesto que funciona como bloqueante de canales de sodio. En una realización específica, el compuesto es un compuesto sintético. En una realización, el compuesto sintético se

selecciona entre lidocaína, mexiletina, carbamazepina, amitriptilina y bifenil pirazoles, o una combinación de los mismos. En otra realización, el compuesto es una toxina. En una realización específica, la toxina se selecciona entre tetrodotoxina y neosaxitosina o una combinación de las mismas.

En una realización, se proporcionan animales no humanos modificados por ingeniería genética que expresan una subunidad-a de Nav1.7 sobre la superficie de una célula y proporcionan un sistema para ensayar de forma selectiva la funcionalidad (por ejemplo, eficacia) y/o toxicidad de combinaciones de agentes terapéuticos sobre formas mutantes o variantes de un Nav1.7 humano. En una realización, la combinación de agentes terapéuticos comprende proporcionar un efecto sinérgico tras la administración al animal no humano modificado por ingeniería genética. En una realización específica, la combinación de agentes terapéuticos comprende al menos dos de un compuesto sintético, una toxina de origen natural, o una proteína (por ejemplo, un anticuerpo anti-Nav).

En un aspecto, se proporcionan ratones modificados por ingeniería genética que expresan una proteína de canal Nav humano, específicamente una subunidad-a de Nav1.7 humano. Los ratones se modifican por ingeniería genética para incluir todo o sustancialmente todo el gen de Nav1.7 humano.

En una realización, el gen de Nav1.7 humano remplaza un gen de Nav1.7 de ratón endógeno en el locus endógeno de Nav1.7 de ratón.

En un aspecto, se proporcionan ratones modificados por ingeniería genética que expresan una subunidad-a de Nav1.7 quimérica, donde el ratón incluye una subunidad-a de Nav1.7 de ratón modificada con uno o más bucles de poro extracelular que contienen una secuencia correspondiente de un gen de Nav1.7 humano.

En una realización, la subunidad-a de Nav1.7 quimérica comprende un bucle de poro extracelular que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio I que comprende la secuencia correspondiente del gen de Nav1.7 humano. En otra realización, la subunidad-a de Nav1.7 quimérica comprende un bucle de poro extracelular que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio III que comprende la secuencia correspondiente del gen de Nav1.7 humano.

En un aspecto, se proporciona un ratón modificado por ingeniería genética que comprende sustancialmente todo el ADN genómico humano que codifica una proteína Nav1.7. En otro aspecto, el ratón modificado genéticamente comprende una parte de ADN genómico humano, y el ratón expresa una proteína Nav1.7 quimérica.

En una realización, la parte de ADN genómico humano comprende una secuencia humana que codifica el bucle de poro extracelular que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio I del gen de Nav1.7 humano. En otra realización, la parte de ADN genómico humano comprende una secuencia humana que codifica el bucle de poro extracelular que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio III del gen de Nav1.7 humano.

En un aspecto, se proporciona un ratón modificado por ingeniería genética que es capaz de expresar una proteína Nav1.7 humana o quimérica sobre la superficie de una célula del ratón.

En una realización, el Nav1.7 es quimérico y comprende un bucle de poro extracelular humano. En una realización específica, el bucle de poro extracelular humano es el bucle que conecta los segmentos transmembrana 5 y 6 del dominio I. en otra realización específica, el bucle de poro extracelular humano es el bucle que conecta los segmentos... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar un antagonista de Nav1.7, que comprende:

(a) proporcionar ex vivo una célula que expresa una proteína de subunidad-a de Nav1.7 humano de longitud completa, o una proteína de subunidad-a de Nav1.7 quimérico que comprende un bucle extracelular de los dominios I o III de la subunidad-a de Nav1.7 de ratón que se ha remplazado por el correspondiente bucle de una subunidad-a de Nav1.7 humano;

(b) poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo que se une a, o bloquea una función de, la proteína de subunidad-a de Nav1.7 humano o de la proteína de subunidad-a de Nav1.7 quimérico de (a) y esperar un primer periodo de tiempo;

(c) poner en contacto la célula de (b) con uno o más mediadores inflamatorios y esperar un segundo periodo de tiempo;

(d) determinar la cantidad de péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) liberado de la célula después de la etapa (c); y

(e) comparar la cantidad de CGRP liberado en la etapa (d) con la cantidad de CGRP liberado en presencia de un inhibidor conocido de canales de sodio, en donde un aumento en CGRP liberado en presencia de un compuesto de ensayo indica inhibición de Nav1.7.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la célula es una célula neuronal, preferiblemente en el que la célula neuronal es una célula del ganglio de la raíz dorsal (DRG).

3. El método de la reivindicación 2, en el que la célula es una célula de ratón.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad de CGRP liberado en presencia del compuesto de ensayo inhibe una o más funciones de la proteína Nav1.7 humana o quimérica y es al menos 2 veces mayor que el inhibidor conocido de canales de sodio.

5. Un método para identificar un antagonista de Nav1.7, que comprende:

(a) poner en contacto una célula DRG que expresa una proteína de subunidad-a de Nav1.7 humano de longitud completa, o una proteína de subunidad a de Nav1.7 quimérico que comprende un bucle extracelular de los dominios I o III de la subunidad-a de Nav1.7 de ratón que se ha remplazado por el correspondiente bucle de una subunidad-a de Nav1.7 humano con un compuesto de ensayo que se une a, o bloquea una función de, la proteína de subunidad-a de Nav1.7 humano o de la proteína de subunidad-a de Nav1.7 quimérico y esperar un primer periodo de tiempo;

(b) poner en contacto el DRG de (a) con uno o más mediadores inflamatorios y esperar un segundo periodo de tiempo;

(c) determinar la cantidad de péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) liberado del DRG después de la etapa (b); y

(d) comparar la cantidad de CGRP liberado en la etapa (c) con la cantidad de CGRP liberado en presencia de un inhibidor conocido de canales de sodio, en donde un aumento en CGRP liberado en presencia de un compuesto de ensayo indica inhibición de Nav1.7.

6. El método de las reivindicaciones 1 o 5, en el que el agente se selecciona entre un anticuerpo, un péptido, un compuesto orgánico y una toxina, preferiblemente en el que el anticuerpo es humano.

7. El método de las reivindicaciones 1 o 5, en el que el uno o más mediadores inflamatorios se seleccionan entre prostaglandina E2, bradicinina, capsaicina, protones y un factor neurotrófico, preferiblemente en el que el uno o más mediadores inflamatorios son prostaglandina E2, bradicinina y capsaicina.

8. El método de la reivindicación 5, en el que el DRG se aísla de un miembro del grupo que consiste en ser humano, ratón, rata o mono, preferiblemente en el que el DRG se aísla de un ratón.

9. El método de las reivindicaciones 1 o 5, en el que la célula se aísla de un ratón modificado genéticamente que comprende, en su línea germinal, una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad-a de Nav1.7 humano o un fragmento de la misma unida de forma funcional a un promotor Nav.

10. El método de las reivindicaciones 1 o 5, en el que el inhibidor conocido de canales de sodio es tetrodotoxina o ProTx-ll.

11. El método de las reivindicaciones 1 o 5, en el que la proteína de subunidad-a de Nav1.7 humano de longitud completa está codificada por los exones 2 a 28 de un gen de Nav1.7 humano.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la proteína de subunidad-a de Nav1.7 humano de longitud completa

es una variante de Nav1.7 humano.

13. El método de la reivindicación 12, en el que la variante de Nav1.7 humano comprende una sustitución de aminoácido seleccionada entre Q10R, I136V, F216S, S241T, N395K, V400M, L823R, I848T, L858H, L858F, A863P,

V872G, F1449V, o una combinación de las mismas.

14. El método de la reivindicación 12, en el que la variante de Nav1.7 humano comprende una sustitución de aminoácido seleccionada entre R996C, V1298D, V1298F, V1299F, I1461T, F1462V, T1464I, M1627K, A1632E, o una combinación de las mismas.

15. El método de la reivindicación 12, en el que la variante de Nav1.7 humano comprende una sustitución de aminoácido seleccionada entre F1200L, 11235L, o una combinación de las mismas.