Ensayo de distinción.

Un método para la determinación de un anticuerpo contra un anticuerpo de fármaco (anticuerpo anti-fármaco,

ADA) en una muestra con un inmunoensayo, en el que dicho método comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar

a-i) un anticuerpo de captura de fármacos, en el que dicho anticuerpo de fármaco está conjugado a una fase sólida,

a-ii) un anticuerpo trazador de fármaco, en el que dicho anticuerpo de fármaco está conjugado a un marcador detectable,

b) poner en contacto dicho anticuerpo de captura de fármacos por separado con

b-i) dicha muestra,

b-ii) dicha muestra, a la que se ha añadido dicho anticuerpo de fármaco en forma monomérica,

b-iii) dicha muestra, a la que se ha añadido dicho anticuerpo de fármacos en forma oligomérica,

c) determinar un anticuerpo contra dicho anticuerpo de fármacos en dicha muestra mediante un inmunoensayo positivo en b-i) y un inmunoensayo negativo en b-ii) y b-iii).

Ensayo de distinción

La invención comprende un método para distinguir la presencia de anticuerpos anti-fármacos específicos y no específicos en una muestra, así como equipos para el uso de tal método.

Antecedentes de la invención

Los inmunoensayos en fase sólida estándar con anticuerpos monoclonales implican la formación de un complejo entre el anticuerpo adsorbido en una fase sólida (anticuerpo de captura), el antígeno, y el anticuerpo a otro epítopo del antígeno conjugado con un marcador detectable, por ejemplo, una enzima (anticuerpo trazador). Por lo tanto, se forma un sándwich: fase sólida - anticuerpo de captura - antígeno - anticuerpo trazador. En la reacción catalizada por el sándwich, la actividad del anticuerpo - enzima conjugada es proporcional a la concentración de antígeno en el medio de incubación. El método sándwich estándar también se llama inmunoensayo de puente de doble antígeno ya que los anticuerpos de captura y de trazadores se unen a diferentes epítopos del mismo antígeno. Hoesel, W., et al., J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110, informan de un ensayo de puente de doble antígeno anti-EPO mediante el cual se utilizó una mezcla de rhEPO inmovilizado acoplado a grupos amino y grupos carbohidrato. Los inmunoensayos tales como el ELISA puente de doble antígeno son tipos de ensayo comunes en la investigación de una respuesta inmunogénica de un paciente a un anticuerpo de un medicamento. Mire-Sluis, A. R., et al., J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16, resume las recomendaciones para el diseño y optimización de inmunoensayos basados en la detección de anticuerpos del huésped contra los productos biotecnológicos. Según Mire-Sluis et al. los formatos de ensayo de anticuerpos anti-fármacos conocidos muestran desventajas considerables. Se mencionan ensayos de anticuerpos anti- fármacos, por ejemplo, en el documento WO 2005/045058 y WO 90/006515. Se mencionan ensayos de anticuerpos antiidiotípicos, por ejemplo, en el documento US 5.219.730, WO 87/002778, PE 0 139 389 y PE 0 170 302. Wadhwa, M., et al., J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17, describen estrategias para la detección, medición y caracterización de anticuerpos no deseados inducidos por productos biológicos terapéuticos. Los principios de diferentes Inmunoensayos se describen, por ejemplo, en Hage, D.S., Anal. Chem. 71 (1999) 294R- 304R. Lu, B., et al., Analyst. 121 (1996) 29R-32R, describen la inmovilización orientada de anticuerpos para el uso en inmunoensayos. Los inmunoensayos mediados por avidina-biotina se describen, por ejemplo, en Wilchek, M., y Bayer, EA, Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469. Una comparación de ELISA y resonancia de plasmón superficial se describe en Lofgren, J.A., et al., J. Immunol. 178 (2007) 7467 - 7472.

Lofgren, J. A., et al. describió la comparación de ELISA y resonancia de plasmones de superficir para evaluar la ¡nmunogenlcldad clínica de Panitumumab (J. Immunol. 178 (2007) 7467-7472).

Resumen de la invención

El primer aspecto de la presente invención es un método para la determinación de un anticuerpo contra un anticuerpo de fármacos (anticuerpo antifármaco, ADA) en una muestra usando un inmunoensayo que comprende un anticuerpo de captura de fármacos y un anticuerpo trazador de fármaco, en el que dicho método comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar

a-i) dicho anticuerpo de captura de fármacos, que es dicho anticuerpo de fármaco conjugado a una fase sólida, a-ii) dicho anticuerpo trazador de fármaco, que es dicho anticuerpo de fármaco conjugado a un marcador detectable,

b) poner en contacto dicho anticuerpo de captura de fármacos separadamente con b-i) dicha muestra,

b-ii) dicha muestra, a la que dicho anticuerpo de fármacos en forma monomérica se ha añadido antes del inmunoensayo,

b-iii) dicha muestra, a la que dicho anticuerpo de fármacos en forma oligomérica se ha añadido antes del inmunoensayo,

c) determinar un anticuerpo contra dicho anticuerpo de fármacos en dicha muestra mediante un inmunoensayo positivo en bi) y un inmunoensayo negativo en b-ii) y b-iii).

Otro aspecto de la presente invención es un método para determinar la presencia de anticuerpos anti-fármacos oligoméricos en una muestra con un inmunoensayo, en el que el método comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar

a-i) dicho anticuerpo de captura de fármacos, que es dicho anticuerpo de fármaco conjugado a una fase sólida, a-ii) dicho anticuerpo trazador de fármaco, que es dicho anticuerpo de fármaco conjugado a un marcador detectable,

b) poner en contacto dicho anticuerpo de captura de fármacos por separado con b-i) dicha muestra,

b-ii) dicha muestra, a la que se ha añadido dicho anticuerpo de fármaco en forma monomérica, b-iii) dicha muestra, a la que se ha añadido dicho anticuerpo de fármacos en forma oligomérica, b-iv) dicha muestra, a la que se ha añadido la inmunoglobulina G humana en forma monomérica, b-v) dicha muestra, a la que se ha añadido la inmunoglobulina G humana en forma oligomérica,

c) determinar si el anticuerpo anti-fármaco en una muestra está en forma oligomérica mediante un inmunoensayo positivo en bi) y bii) y b-vi) y b-v) y un inmunoensayo negativo en b-iii).

La clase de un anticuerpo anti-fármaco se determina de acuerdo a la siguiente tabla:

Un aspecto final de la presente invención es un método para determinar la presencia de anticuerpos anti-fármacos monoméricos en una muestra con un inmunoensayo, en el que el método comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar

a-i) un anticuerpo de captura de fármacos, que es dicho anticuerpo de fármaco conjugado a una fase sólida, a-ii) un anticuerpo trazador de fármaco, que es dicho anticuerpo de fármaco conjugado a un marcador detectable,

b) poner en contacto dicho anticuerpo de captura de fármacos por separado con b-i) dicha muestra,

b-ii) dicha muestra, a la que se ha añadido dicho anticuerpo de fármacos en forma monomérica, b-iii) dicha muestra, a la que se ha añadido dicho anticuerpo de fármacos en forma oligomérica, b-iv) dicha muestra, a la que se ha añadido la inmunoglobulina G humana en forma monomérica, b-v) dicha muestra, a la que se ha añadido la inmunoglobulina G humana en forma oligomérica,

c) determinar si el anticuerpo anti-fármaco en una muestra está en forma monomérica mediante un inmunoensayo positivo en bi) y b-iv) y b-v) y un inmunoensayo negativo en b-ii) y b-iii).

En una realización de los aspectos de la invención, dicho inmunoensayo es un inmunoensayo de puente de doble antígeno que comprende un anticuerpo de captura de fármacos y un anticuerpo trazador de fármaco. Otra forma de realización de los aspectos de la invención es que dicho anticuerpo es un anticuerpo de fármacos para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria. En una realización, dicho anticuerpo para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria es un anticuerpo para el tratamiento de la artritis reumatoide o la osteoartritis. En otra realización dicho anticuerpo para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria es un anticuerpo contra el receptor de IL-6, o contra el receptor de IGF-1, o contra el receptor alfa 1 de IL-13. Una forma de realización de los aspectos de la presente invención comprende que dicho anticuerpo de captura de fármacos es una mezcla de dicho anticuerpo de fármaco que comprende al menos dos de dichos anticuerpos de fármacos que difieren en el sitio de anticuerpo en el que se conjugan... [Seguir leyendo]

1. Un método para la determinación de un anticuerpo contra un anticuerpo de fármaco (anticuerpo anti-fármaco, ADA) en una muestra con un inmunoensayo, en el que dicho método comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar

a-i) un anticuerpo de captura de fármacos, en el que dicho anticuerpo de fármaco está conjugado a una fase sólida, a-ii) un anticuerpo trazador de fármaco, en el que dicho anticuerpo de fármaco está conjugado a un marcador detectable,

b) poner en contacto dicho anticuerpo de captura de fármacos por separado con b-i) dicha muestra,

b-ii) dicha muestra, a la que se ha añadido dicho anticuerpo de fármaco en forma monomérica, b-iii) dicha muestra, a la que se ha añadido dicho anticuerpo de fármacos en forma oligomérica,

c) determinar un anticuerpo contra dicho anticuerpo de fármacos en dicha muestra mediante un inmunoensayo positivo en b-i) y un inmunoensayo negativo en b-ii) y b-iii).

2. Un método para determinar la presencia de anticuerpos anti-fármacos oligoméricos en una muestra con un inmunoensayo, en el que el método comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar

a-i) un anticuerpo de captura de fármacos, en el que dicho anticuerpo de fármacos está conjugado a una fase sólida, a-ii) un anticuerpo trazador de fármaco, en el que dicho anticuerpo de fármaco está conjugado a un marcador detectable,

b) poner en contacto dicho anticuerpo de captura de fármacos por separado con

b-i) dicha muestra,

b-ii) dicha muestra, a la que ha sido añadido dicho anticuerpo de fármacos en forma monomérica, b-iii) dicha muestra, a la que se ha añadido dicho anticuerpo de fármacos en forma oligomérica, b-iv) dicha muestra, a la que se ha añadido la ¡nmunoglobulina G humana en forma monomérica, b-v) dicha muestra, a la que se ha añadido la ¡nmunoglobulina G humana en forma oligomérica,

c) determinar el anticuerpo anti-fármaco en una muestra sea de forma oligomérica mediante un inmunoensayo positivo en b-i) y b-ii) y b-iv) y b-v) y un inmunoensayo negativa en b-iii).

3. Un método para determinar la presencia de anticuerpos anti-fármacos monoméncos en una muestra con un inmunoensayo, en el que el método comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar

a-i) un anticuerpo de captura de fármacos, que es dicho anticuerpo de fármaco conjugado a una fase sólida, a-ii) un anticuerpo trazador de fármaco, que es dicho anticuerpo de fármaco conjugado a un marcador detectable,

b) poner en contacto dicho anticuerpo de captura de fármacos por separado con b-i) dicha muestra,

b-ii) dicha muestra, a la que se ha añadido dicho anticuerpo de fármacos en forma monomérica, b-iii) dicha muestra, a la que se ha añadido dicho anticuerpo de fármacos en forma oligomérica, b-iv) dicha muestra, a la que se ha añadido la ¡nmunoglobulina G humana en forma monomérica, b-v) dicha muestra, a la que se ha añadido la ¡nmunoglobulina G humana en forma oligomérica,

c) determinar si el anticuerpo anti-fármaco en la muestra está en forma monomérica mediante un inmunoensayo positivo en b-i) y b-iv) y b-v) y un inmunoensayo negativo en b-ii) y b-iii).

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho inmunoensayo es un inmunoensayo puente de doble antígeno que comprende un anticuerpo de captura de fármacos y un anticuerpo trazador de fármacos.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo de fármacos para el tratamiento de una enfermedad ¡nflamatoria.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque dicho anticuerpo para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria es un anticuerpo para el tratamiento de la artritis reumatoide o la osteoartritis.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque dicho anticuerpo para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria es un anticuerpo contra el receptor de IL-6, o contra el receptor de IGF-1, o contra el receptor alfa 1 de IL-13.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho anticuerpo de captura de fármacos es una mezcla de dicho anticuerpo de fármacos que comprende al menos dos de dichos anticuerpos de fármacos que difieren en el sitio de anticuerpo en el que se conjugan a la fase sólida, y el anticuerpo trazador de fármaco es una mezcla de dicho anticuerpo de fármaco que comprende al menos dos de dichos anticuerpos de fármacos que difieren en el sitio de anticuerpo en el que se conjugan con el marcador detectable.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la mezcla de anticuerpos de captura de fármacos o la mezcla de anticuerpos trazadores de fármacos comprende un anticuerpo conjugado de fármacos conjugado a través de un grupo amino y un anticuerpo de fármacos conjugado a través de una estructura de hidratos de carbono a su pareja de conjugación.

10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo de captura de fármacos está conjugado a biotina y la conjugación a la fase sólida se lleva a cabo a través de avidina o estreptavidina inmovilizada.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo trazador de fármaco se conjuga con el marcador detectable a través de una pareja de unión específica.

12. Un método de acuerdo con reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo trazador de fármaco se conjuga con digoxigenina y la unión al marcador detectable se realiza mediante un anticuerpo contra digoxigenina.

13. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proporción anticuerpo de captura de fármaco frente al anticuerpo trazador de fármaco está entre 1:10 y 50:1.