Procedimiento de doble inclusión para el estudio histológico y/o de localización de marcadores moleculares en especímenes pluricelulares de dimensiones microscópicas.

Procedimiento de doble inclusión para el estudio histológico y/o de localización de marcadores moleculares en especímenes pluricelulares de dimensiones microscópicas.

La presente invención se refiere a un procedimiento de doble inclusión de especímenes pluricelulares de dimensiones microscópicas (70-300 μm) que permite mantener la disposición espacial tridimensional de las muestras para, posteriormente, realizar estudios histológicos, inmunohistoquímicos y/o de localización de marcadores moleculares. El procedimiento incluye la preparación de la muestra mediante lavados con solución tamponada; la fijación de la muestra durante 10-15 minutos, a temperatura de 2-8° C; la deshidratación de la muestra con concentraciones crecientes de etanol durante 10-15 minutos cada una, a una temperatura de 2-8° C, la preinclusión en agar y la inclusión en parafina, prescindiendo de la centrifugación de la muestra en todas las etapas del procedimiento. Así mismo, la invención incluye un kit con los elementos necesarios para desarrollar el procedimiento descrito en la invención.

Procedimiento de doble inclusión para el estudio histológico y/o de localización de marcadores moleculares en especímenes pluricelulares de dimensiones microscópicas

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuadra en el sector de la histotecnología. Más concretamente se refiere a un procedimiento de doble inclusión histológica, compuesto por un sistema de preagregación en matriz orgánica biocompatible y de inclusión en parafina, que permite la realización de análisis histológicos seriados, y de localización de marcadores moleculares, particularmente mediante inmunohistoquímica, en especímenes pluricelulares de dimensiones microscópicas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las técnicas de doble inclusión de especímenes de pequeñas dimensiones para el análisis estructural o ultraestructural posterior son conocidas desde hace aproximadamente tres décadas. Los procedimientos utilizados habitualmente incluyen: la fijación de la muestra durante tiempos comprendidos entre doce y veinticuatro horas, seguida de centrifugación si se trata de células, y la preinclusión en agar, agarosa, gelatina o albúmina sérica bovina (BSA), antes o después de la centrifugación. Los procedimientos finalizan con la deshidratación en concentraciones crecientes de etanol en periodos de tiempo de una, o más horas (Harris M.J. (1974). Cytotechnol. Bull. 11:6-7; Moskaluk C.A., Stoler M.H. (2002). Diag. Mol. Pathol. 11: 234- 23).

En fechas recientes, se han desarrollado metodologías dirigidas al análisis ultraestructural de especímenes pluricelulares por microscopía electrónica de transmisión, en las que se reduce a una hora el tiempo de exposición de las

muestras a las soluciones de fijación y se realiza una doble inclusión utilizando diferentes soportes. Como exponentes de esta aproximación, destacan los procedimientos descritos por diversos autores (Dvorak A.M., y cois. (1991). American Journal of Pathology, 138 (1): 69-82; Meló R.C.N., y cois., (2005). Traffic 6: 1047-1057; Meló R.C.N., y cois., (2007). Micron (38) 714-721), que comprenden la fijación de las células en suspensión durante una hora, la inclusión en agar, su centrifugación y la postfijación durante una a dos horas. Posteriormente, en el artículo de Taupin (Taupin, P (2008). Annals of Microscopy 8: 19-21), se describe un procedimiento para procesar células en suspensión para microscopía electrónica. Según este protocolo, las células se fijan en glutaraldehído durante una hora a temperatura ambiente, se incluyen en gelatina al 5% o en albúmina sérica bovina al 5% y posteriormente se entrecruzan con agentes fijadores (paraformaldehído y glutaraldehído) durante 1-1,5 horas a temperatura ambiente. Las piezas de gelatina o BSA se deshidratan en soluciones de etanol a concentración creciente (50%, 75%. 95% y 100%, durante 10, 20, 20 y 20 minutos, respectivamente) y finalmente se incluyen en araldita. Este último procedimiento pretende evitar la centrifugación de la muestra, obtener una pieza sólida para su estudio, mantener las células en suspensión y establecer un tiempo de fijación de la muestra mucho más corto de lo habitual.

En relación con la aplicación de métodos de doble inclusión al análisis estructural e inmunohistoquímico de especímenes de dimensiones microscópicas, éstos se han dirigido mayoritariamente a la investigación con células en cultivo. Entre los procedimientos, destaca el publicado por Gruber y cois. (Gruber HE, y cois., (2009). Biotechnic & Histochemistry 84 (6): 283- 286), en el que se especifica que, cuando la muestra contiene pocos estratos celulares, se requieren periodos reducidos de exposición a la solución de fijación, de una hora, previa centrifugación de la muestra. Estos mismos autores, citan otros procedimientos que también implican un hora de fijación (Tapp, H. y cois., (2008) Arthritis Research & Therapy (10) 4 - R89).

En resumen, el estado actual de la técnica incluye la centrifugación de la muestra celular para obtener un pellet, la exposición del mismo a la solución de fijación durante al menos una hora, la preinclusión en una matriz de agregación que facilite el proceso de inclusión y manipulación macroscópica de la muestra, el corte histológico y el análisis posterior. Los procesos de centrifugación de la muestra y las condiciones de fijación son aspectos críticos de la metodología, que ejercen una influencia notable sobre el mantenimiento de la citoestructura y de las características antigénicas de las células, esenciales para el análisis histológico y la localización de marcadores moleculares, especialmente inmunohistoquímico, de las mismas.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento de doble inclusión para el estudio histológico y/o de localización de marcadores moleculares de especímenes pluricelulares de dimensiones microscópicas, que permite mantener la disposición espacial tridimensional de las muestras. Entre los estudios de localización de marcadores moleculares, destacan especialmente los análisis inmunohistoquímicos.

En la presente memoria descriptiva, se entiende por "espécimen" la entidad biológica que se adopta como muestra, así como el agregado de células del mismo tipo o de tipos diferentes, que puede proceder de cultivos celulares, cultivos bacterianos, aspirados celulares, entre otros, que se considera como muestra.

Asimismo, se entiende por "marcador molecular" toda biomolécula que se puede asociar o correlacionar con un rasgo genético. Las biomoléculas que pueden ser marcadores moleculares son los péptidos y las proteínas (por ejemplo, antígenos e isoenzimas) y los ácidos nucleicos (por ejemplo, genes conocidos o fragmentos de secuencia y/o función desconocida).

El término "inmunohistoquímica", tal y como se utiliza en esta memoria, se refiere a los métodos que se basan en la utilización de anticuerpos mono o policlonales, previamente marcados mediante un enlace químico con una enzima, que no afectan a la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con un antígeno, con utilidad en la detección de antígenos celulares.

El procedimiento de la invención incluye la preagregación de muestras pluricelulares de dimensiones microscópicas en matriz de agar, optimizado para la inclusión en parafina y los cortes histológicos seriados. En los laboratorios de histotecnología, la preinclusión en agar de células procedentes de cultivos celulares se realiza después de la obtención de un pellet por centrifugación, lo que acarrea el inconveniente de alterar la disposición original de las células del cultivo. En el procedimiento de la invención se ha eliminado el paso de centrifugación y se realiza directamente la inclusión en agar, lo que permite mantener la estructura original de la muestra, para su valoración morfológica posterior en las secciones histológicas.

Otro aspecto de la invención se refiere al periodo de tiempo durante el que se realiza la fijación de la muestra, que se ha reducido a entre 10 y 15 minutos, siendo de preferencia de 15 minutos. También se refiere a la temperatura a la que se realiza la fijación, puesto que se han obtenido mejores resultados a temperaturas entre 2 y 8°C.

Por otro lado, la invención incluye periodos de deshidratación de la muestra más reducidos de los que se utilizan habitualmente según el estado de la técnica, dado que el procedimiento que aquí se describe incluye periodos de deshidratación de 10 o 15 minutos, preferentemente de 10 minutos, con cada una de las concentraciones de etanol que se utilizan que, en una realización preferida, son 3 concentraciones en orden creciente. Así mismo, la deshidratación se realiza preferentemente a una temperatura de entre 2 y 8°C.

En una realización preferida, el procedimiento comprende los siguientes pasos:

a) preparación de la muestra mediante lavados con solución tamponada y sin centrifugación previa;

b) fijación de la muestra con un agente fijador durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 15 minutos, a temperatura de 2-8°C;

c) deshidratación de la muestra con concentraciones crecientes de etanol durante 10-15 minutos cada una, a una temperatura de 2-8°C;

d) preinclusión de la muestra en agar sin centrifugación, transfiriendo dicha muestra desde la solución de etanol de deshidratación a una base de agar preparada previamente y en estado de gelificación por descenso térmico;

e) inclusión en parafina.

Por otra parte, en el proceso de validación, se examinó la influencia de las condiciones del procedimiento sobre el mantenimiento de la estructura de los especímenes mediante el análisis histológico y de la integridad antigénica de los mismos, puesto... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de doble inclusión para el estudio histológico y/o de localización de marcadores moleculares de especímenes pluricelulares de dimensiones microscópicas que comprende los siguientes pasos:

a) preparación de la muestra mediante lavados con solución tamponada y sin centrifugación previa;

b) fijación de la muestra con un agente fijador durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 15 minutos, a temperatura de 2-8°C;

c) deshidratación de la muestra con concentraciones crecientes de etanol durante 10-15 minutos cada una, a una temperatura de 2-8°C;

d) preinclusión de la muestra en agar sin centrifugación, transfiriendo dicha muestra desde la solución de etanol de deshidratación hasta una base de agar preparada previamente y en estado de gelificación por descenso térmico;

e) inclusión en parafina.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 que incluye un paso adicional f) de análisis histológico y/o de localización de marcadores moleculares.

3. Procedimiento según la reivindicación 2 en el que los análisis son inmunohistoquímicos.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que los especímenes pluricelulares tienen dimensiones comprendidas entre 70 y 300 pm.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el tiempo de fijación de la muestra es de 15 minutos.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el tiempo de deshidratación de la muestras es de 10 minutos con cada concentración de etanol.

5 7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el

que la deshidratación de la muestra se realiza con 3 concentraciones crecientes de etanol.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el 10 que los especímenes pluricelulares de dimensiones microscópicas se seleccionan del grupo que comprende: embriones no humanos, cuerpos embrioides no humanos, neuroesferas, derivados de diferenciación de células pluripotentes no humanas, fases larvarias o adultas de parásitos, cultivos bacterianos, agregados de células procedentes de cultivos celulares o de 15 aspirados celulares y/o modelos animales microscópicos.