Dispositivo para diagnosticar el estado fisiológico y/o seleccionar los mejores espermatozoides de una muestra de semen en base a quimiotaxis y procedimiento de uso del mismo.

Dispositivo para diagnosticar el estado fisiológico y/o seleccionar espermatozoides de una muestra de semen en base a quimiotaxis,

del tipo que posee dos compartimentos (1a, 1b) comunicados entre si, caracterizado porque dicha comunicación de compartimentos (1a, 1b) se realiza a través de un conducto o puente (2) posicionado inferiormente, y por encima del nivel inferior de los mencionados compartimentos (1a, 1b); posicionándose en las entradas de dichos compartimentos (1a, 1b) correspondientes medios de cierre (3, 4) y correspondientes conductos de egreso de aire (5) que comunican el extremo superior de los compartimentos (1a, 1b) con el exterior, en donde dichos medios de cierre (3, 4) están compuestos por un tapón con un apéndice (3) y un anillo elástico (4) y en donde el extremo inferior de los compartimentos (1a, 1b) tienen una base cónica (6).

Dispositivo para diagnosticar el estado fisiológico y/o seleccionar los mejores espermatozoides de una muestra de semen en base a quimiotaxis y procedimiento de uso del mismo Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a un dispositivo para diagnosticar el estado fisiológico y/o seleccionar los mejores espermatozoides de una muestra de semen en base a quimiotaxis, y al procedimiento de uso del mismo, permitiendo mediante un dispositivo simple y económico, diagnosticar y seleccionar los mejores espermatozoides en un solo paso. Solo será necesario contar con el presente dispositivo, un microscopio óptico común, y personal con conocimiento elemental de manejo de laboratorio.

Estado de la técnica

La quimiotaxis del espermatozoide es un mecanismo de transporte celular que guía a los espermatozoides hacia un gradiente de concentración de un atractante. En los últimos años se han realizado esfuerzos para poder diferenciar la quimiotaxis de un proceso de acumulación de células mediado por otros mecanismos.

El proceso de quimiotaxis ha sido observado en diferentes especies de mamíferos, por ejemplo humanos, ratones, conejos y otras.

Por otra parte, se sabe que la progesterona es el principal esteroide del microambiente del huevo en el momento de la ovulación y ha mostrado ser un buen atractante de espermatozoides.

En los documentos de patentes PCT WO 02/090373, WO 00/09648 y WO 99/66331 se divulgan métodos y dispositivos para evaluar la quimiotaxis de espermatozoides, los cuales constan básicamente de dos compartimientos verticales separados por un filtro, donde el atractante se coloca en el inferior y los espermatozoides en el superior. La utilidad secundaria que le otorgan al dispositivo sería la de evaluar quimiotaxis, basado en la acumulación de espermatozoides obtenida al cabo de un tiempo en el compartimiento que contiene el atractante. Esta metodología no permite diferenciar quimiotaxis de otros procesos que provocan acumulación celular.

El documento de patente PCT WO 2005/027634 propone otro método para aislar espermatozoides capacitados. La selección espermática se realiza en base a la capacidad de los espermatozoides de responder a un gradiente de temperatura, es decir que, nadan de un lugar más frío a uno más cálido. El dispositivo cuenta con un sistema externo de calentamiento diferencial del fluido de cada compartimiento. Cada compartimiento requiere la regulación de la temperatura con una diferencia de tan solo 2°C entre ambos, ubicados a una distancia de 1 mm. Esta particularidad física se logra con un equipo adicional de regulación térmica, lo cual dificulta notablemente la manipulación del dispositivo en cuestión. La eficiencia del enriquecimiento es del 10%.

La patente WO 2005/009222 propone un método sólo para diagnosticar el estado fisiológico de una muestra de semen basado en la detección del nivel espermatozoides capacitados. El invento propone un protocolo que involucra la muerte celular, el cual solo serviría para diagnosticar una muestra, ya que los espermatozoides capacitados no podrían ser recuperados para su posterior uso en fecundación asistida.

La patente US 5.849.713 se relaciona con factores de quimiotáctica para espermatozoides humanos. La actividad quimiotáctica se determina por un ensayo capilar descripto allí.

El artículo "Progesterone at the picomolar range is a chemoattractant for mammalian spermatozoa" de Teves et al. publicado en "Fertility and Sterility", Vol. 86, nro. 3 en 2006, divulga, por medio de un sistema de videomicrocospía y un análisis de imagen por computadora, ensayos de quimiotaxis para detectar quimiotaxis verdadera en espermatozoides humanos, en paralelo a la detección de immunohistoquímica de progesterona dentro de células del cumulus.

El artículo "Applications of a microfabricated devide for evaluating sperm function" de Kricka et al. publicado en "Clinical Chemistr y ", Vol. 39, nro. 9 en 1993 divulga inter alia la valoración simultánea de la potencia de diferentes espermicidas y concentraciones de espermicida utilizando estructuras que comprenden compartimentos que contienen espermicida conectados por canales a un compartimento central en el cual se introduce semen.

El artículo "Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex" de Guirobaldi et al. publicado en "PLOS ONE", Vol. 3, nro. 8 en 2008 divulga la identificación de quimiotaxis de esperma en mamíferos hacia varias fuentes femeninas como fluído folicular, fluido de oviducto, y medio acondicionado del cumulus oophorus y el ovocito.

El artículo "Chemotaxis assays of mouse sperm on microfluidic devices" de Koyama et al. publicado en "Analytical Chemistr y ", Vol. 78, nro. 10, en 2006 divulga un dispositivo microfluídico para medir quimiotaxis de espermatozoides.

El artículo "Chemotaxis of capacitated rabbit sermatozoa to folicular fluid revealed by a novel directionality-based assay" de Fabro et al. publicado en "Biology of Reproduction", Vol. 67, nro. 5 en 2002 divulga quimiotaxis de espermatozoides hacia factor (es) en fluido folicular en humanos y ratones.

Breve descripción de la invención En la presente invención se muestra un dispositivo para diagnosticar el estado fisiológico y/o seleccionar espermatozoides de una muestra de semen en base a quimiotaxis, del tipo que posee dos compartimentos (1a, 1b) comunicados entre si, en donde dicha comunicación de compartimentos (1a, 1b) se realiza a través de un conducto o puente (2) posicionado inferiormente, y por encima del nivel inferior de los mencionados compartimentos (1a, 1b) ; posicionándose en las entradas de dichos compartimentos (1a, 1b) correspondientes medios de cierre (3, 4) y correspondientes conductos de egreso de aire (5) que comunican el extremo superior de los compartimentos (1a, 1b) con el exterior, en donde dichos medios de cierre (3, 4) están compuestos por un tapón con un apéndice (3) y un anillo elástico (4) y en donde el extremo inferior de los compartimentos (1a, 1b) tiene una base cónica. Preferentemente, el anillo elástico es de goma y dichos compartimentos (1a, 1b) , puente (2) y conductos de egreso de aire (5) están conformados en un cuerpo de material acrílico biocompatible transparente.

En la presente invención se muestra un procedimiento para diagnosticar el estado fisiológico y/o seleccionar los mejores espermatozoides de una muestra de semen en base a quimiotaxis usando el dispositivo de acuerdo con la invención, que comprende llevar a cabo las siguientes etapas:

a) colocar un medio de cierre (3) en uno de los compartimientos (1a) ;

b) llenar el puente (2) vertiendo el medio de cultivo a través del compartimiento restante (1b) ;

c) colocar la suspensión de espermatozoides en el compartimiento (1b) sin medio de cierre y colocar el medio de cierre (3) ;

d) extraer el medio de cierre (3) del primer mencionado compartimiento (1a) y llenar con medio de cultivo o medio atractante;

e) incubar el dispositivo;

f) recuperar la solución del compartimiento (1a) ;

En una variante de realización del procedimiento anterior, es posible adicionarlas etapas de: g) colocar el tapón en dicho compartimiento (1a) ; h) destapar el compartimiento (1b) ; y i) recuperar la solución del compartimiento (1b) .

Breve descripción de las figuras

A fin de hacer más inteligible el objeto de la presente invención, ha sido ilustrado con una figura esquemática, en su forma de realización preferida, las cuales asumen un carácter de ejemplo demostrativo, en donde:

Las figuras 1a, 1b y 1c ilustran respectivas vistas superior, frontal y lateral del dispositivo de la presente invención;

La figura 2 muestra un corte según la línea A-A de la figura 1c;

La figura 3 muestra un corte según la línea A-A de la figura 1c con la incorporación de un medio de cierre;

La figura 4 muestra un gráfico de la concentración optima de espermatozoides (E) utilizados en la separación espermática. Los valores representan la Media ± SEM del porcentaje de espermatozoides acumulados en el compartimiento 1a por quimiotaxis, (n= 3) . * p<0.05, ***p<0.001 vs. 6 millones E/ml.

La figura 5 muestra un gráfico de la concentración de Progesterona empleada en la separación espermática. Los valores representan la Media ± SEM del porcentaje de espermatozoides acumulados en el compartimiento 1a por quimiotaxis, (n= 3) . *p<0.01 vs. 10 pM de progesterona.

La figura 6 muestra un gráfico de los tiempos de incubación empleados para la separación espermática. Los valores representan la Media ± SEM del porcentaje de espermatozoides acumulados en el compartimiento... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo para diagnosticar el estado fisiológico y/o seleccionar espermatozoides de una muestra de semen en base a quimiotaxis, del tipo que posee dos compartimentos (1a, 1b) comunicados entre si, caracterizado porque 5 dicha comunicación de compartimentos (1a, 1b) se realiza a través de un conducto o puente (2) posicionado inferiormente, y por encima del nivel inferior de los mencionados compartimentos (1a, 1b) ; posicionándose en las entradas de dichos compartimentos (1a, 1b) correspondientes medios de cierre (3, 4) y correspondientes conductos de egreso de aire (5) que comunican el extremo superior de los compartimentos (1a, 1b) con el exterior, en donde dichos medios de cierre (3, 4) están compuestos por un tapón con un apéndice (3) y un anillo elástico (4) y en donde el extremo inferior de los compartimentos (1a, 1b) tienen una base cónica (6) .

2. Dispositivo, de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizado porque dichos compartimentos (1a, 1b) , puente (2) y conductos de egreso de aire (5) están conformados en un cuerpo de material acrílico biocompatible transparente.

3. Dispositivo, de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizado porque dichos compartimentos (1a, 1b) presentan una longitud de 12 mm y un diámetro de 4 mm con extremos base cónicos y una capacidad equivalente a 130 µl, y el conducto ó puente (2) posee 2 mm de longitud y un diámetro de 2 mm con una capacidad equivalente a 20 µl.

4. Dispositivo, de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizado porque está fabricado en material acrílico 20 biocompatible y necesariamente transparente para un uso eficiente del dispositivo.

5. Procedimiento para diagnosticar el estado fisiológico y/o seleccionar espermatozoides de una muestra de semen en base a quimiotaxis utilizando el dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende llevar a cabo las siguientes etapas:

a) colocar un medio de cierre (3) en unos de los compartimientos (1a) ;

b) llenar el puente (2) vertiendo el medio de cultivo o medio atractante a través del compartimiento restante (1b) ;

c) colocar la suspensión de espermatozoides en el compartimiento (1b) sin medio de cierre y colocar el medio de cierre (3) ;

d) extraer el medio de cierre (3) del primer mencionado compartimiento (1a) y llenar con medio de cultivo o medio atractante; 35 e) incubar el dispositivo.

f) recuperar la solución del compartimiento (1a) ;

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 caracterizado porque posterior a la etapa "f" se realizan las siguientes etapas:

g) colocar el tapón en dicho compartimiento (1a) ;

h) destapar el compartimiento (1b) ;

i) recuperar la solución del compartimiento (1b) .

7. Procedimiento de acuerdo con las reivindicación 5, caracterizado porque el atractante es progesterona. 50

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el semen es semen de un mamífero

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el semen es semen de especies de otros

grupos zoológicos. 55

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el medio atractante comprende progesterona a una concentración entre 1 a 100 pM.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa e) de incubado se lleva a cabo

durante un periodo de tiempo entre 10 y 30 minutos a una temperatura de 37°C y en un ambiente con 5% d e CO2 en aire.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque la suspensión de espermatozoides de la etapa c) tiene una concentración de espermatozoides de entre 1x106 y 9, 9x106 de espermatozoides móviles/ml. 65