Detección de ácidos nucleicos y proteínas.

Un método para detectar múltiples analitos en una muestra, comprendiendo dicho método las etapas de:

obtener una muestra que comprende al menos un ácido nucleico diana y al menos una proteína diana; introducir un aptámero que se une a la proteína diana en la muestra; y

realizar un único ensayo, en el que el ensayo detecta el ácido nucleico diana y la proteína diana, comprendiendo dicho ensayo las etapas de:

retirar el aptámero no unido del complejo de aptámero-proteína;

realizar una PCR con el ácido nucleico diana;

realizar una PCR con el aptámero;

introducir una primera sonda marcada de modo detectable que se une al ácido nucleico diana amplificado;

introducir una segunda sonda marcada de modo detectable que se une al aptámero amplificado;

detectar la primera sonda, detectando con ello el ácido nucleico en la muestra; y

detectar la segunda sonda que está unida al aptámero amplificado, en el que la detección de la segunda sonda detecta la proteína diana.

Detección de ácidos nucleicos y proteínas Solicitud relacionada La presente descripción reivindica el beneficio y la prioridad de la solicitud de patente de EEUU no provisional nº de serie 12/819.700, presentada el 21 de junio, 2010, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

Campo de la invención La invención se refiere, en general, a métodos para detectar un ácido nucleico diana y una proteína diana en un único ensayo.

Antecedentes Los ensayos de diagnóstico basados en múltiples biomarcadores se han empleado solo de un modo limitado. Por ejemplo, se han propuesto ensayos en los que se mide la expresión génica en varios genes para evaluar el estado clínico. Además, se han empleado múltiples analitos de proteínas para seleccionar la presencia de uno cualquiera de múltiples trastornos cuando el diagnóstico no está claro. En general, se utilizan algoritmos para evaluar los resultados de cualquier ensayo convencional y, en particular, para evaluar si son necesarios más ensayos. Sin embargo, puesto que diferentes tipos de biomarcadores proporcionan resultados informativos, la mayoría de los ensayos se han limitado a seleccionar un único marcador o analito por trastorno.

Es habitual seleccionar múltiples analitos procedentes de la misma muestra para diferentes indicaciones clínicas. Esto es especialmente cierto cuando un paciente presenta síntomas ambiguos. Por ejemplo, una única muestra de sangre puede seleccionarse para el hematocrito, el antígeno de la hepatitis, el VIH y el SARS. Sin embargo, cada una de estas selecciones se dirige a un trastorno clínico diferente y está ligado a un algoritmo diferente para producir distintos resultados para cada una de las indicaciones clínicas que pretende medir el marcador. Esta selección amplia se emplea para realizar un descarte en una o más vías de diagnóstico en una situación en la que el diagnóstico es ambiguo o difícil.

Si se aumenta el número de biomarcadores en cualquier ensayo de selección, se aumenta también la precisión del diagnóstico. Sin embargo, no existe ningún ensayo que permita la selección y/o el diagnóstico de un trastorno basándose en una pluralidad de biomarcadores. Por tanto, en la técnica son necesarios ensayos y algoritmos de diagnóstico que permitan la selección y el diagnóstico de un trastorno basados en múltiples biomarcadores.

Sumario La invención proporciona métodos para determinar el estado clínico de un paciente. En particular, la invención proporciona métodos para crear una lectura de diagnóstico basada en el análisis de múltiples analitos o biomarcadores. En la práctica, los métodos de la invención proporcionan la capacidad para seleccionar pacientes basándose en una pluralidad de biomarcadores en un único formato de ensayo.

Los métodos de la invención son particularmente útiles en la evaluación de diagnósticos complejos. La invención permite el análisis múltiple de una pluralidad de biomarcadores para aumentar el poder de diagnóstico y la precisión del resultado. Según un aspecto de la invención, se evalúa una pluralidad de diferentes biomarcadores obtenidos de la muestra de un paciente. Los resultados después se normalizan y se produce una puntuación de diagnóstico basada en los datos normalizados de los biomarcadores. En una realización preferida, se obtienen los niveles de cada uno de una pluralidad de biomarcadores en la muestra de un paciente. Después, a cada biomarcador se le asigna un resultado binario (por ejemplo, un 1 o un 0) basándose en si el nivel detectado del biomarcador en la muestra del paciente está por encima de un umbral predeterminado. Después, se obtiene una puntuación acumulada añadiendo los resultados binarios para producir una puntuación de diagnóstico que se emplea en la evaluación clínica. En otra realización preferida, los resultados de los biomarcadores se ponderan basándose en criterios de diagnóstico conocidos y/o la historia, el estilo de vida, los síntomas y similares, del paciente. La puntuación ponderada agragada resultante se emplea para la evaluación clínica.

En ciertas realizaciones de la invención, no es necesario que la lectura de la pluralidad de biomarcadores sea binaria. Por el contrario, la lectura puede tomar en consideración el valor predictivo de cada uno de los biomarcadores para el trastorno que se está evaluando. Esta es una forma de ponderar basándose en factores de riesgo conocidos, criterios de diagnóstico y la historia del paciente, y puede afinarse para reflejar el grado de confianza esperado del ensayo. Los métodos de la invención permiten la generación de una firma basada en los resultados obtenidos de una pluralidad de biomarcadores, en la que la firma es indicativa de la presencia/ausencia de una enfermedad, el estadio de la enfermedad o factores de prognóstico (tales como la probabilidad de recurrencia, la evaluación de la respuesta al tratamiento, y el riesgo de desarrollar la enfermedad) .

Los métodos de la invención emplean la medición de numerosos marcadores diferentes que tienen una relación predictiva o un posible valor predictivo en el diagnóstico, la prognósis, la selección terapéutica, la eficacia terapéutica, el rasgo fisiológico y/o la probabilidad de recurrencia. El poder predictivo de la evaluación de diagnóstico múltiple crea una ventaja significativa en términos de especificidad y sensibilidad del ensayo. El poder predictivo del ensayo reside en su capacidad para obtener resultados de una serie de marcadores diferentes y combinarlos en una única firma de diagnóstico o resultado que incluye el poder predicitvo de cada uno de los marcadores individuales para producir un resultado muy sensible y muy específico.

Por consiguiente, en una realización de la invención, se mide una pluralidad de biomarcadores en una muestra obtenida de un paciente. La pluralidad de biomarcadores se selecciona de proteínas (que incluyen anticuerpos, enzimas, etc.) , ácidos nucleicos, carbohidratos, azúcares, bacterias, virus, pH, ácidos, bases, vitaminas, iones, hormonas, y fármacos. En algunos casos, por ejemplo en el caso de ácidos nucleicos y proteínas, los niveles de expresión pueden medirse a lo largo del tiempo. En otros casos, los niveles de un biomarcador se obtienen en las unidades que son apropiadas para ese biomarcador. Los niveles pueden normalizarse opcionalmente a través de un panel entero de biomarcadores, o puede asignarse un resultado binario basándose en si se ha sobrepasado o no un umbral.

En algunas realizaciones, los resultados de un panel de biomarcadores se emplean en una selección de diagnóstico tal cual se obtienen de un ensayo individual de los diversos biomarcadores. En otros casos, la normalización se produce antes de la determinación del diagnóstico, y en otros casos, los resultados de los biomarcadores simplemente son asignados a una unidad binaria (por ejemplo, un 1 o un 0) . Después se evalúan los resultados acumulados basándose en una entrada binaria acumulada (es decir, la suma de todos los 1 y 0) , o basándose en las medias ponderadas, o basándose en una firma generada por el panel de marcadores elegidos.

Los marcadores elegidos para los ensayos de diagnóstico múltiple de la invención se eligen basándose en su valor predictivo o su presunto valor predictivo para el trastorno o trastornos que se están diagnosticando. Los marcadores concretos se seleccionan basándose en diversos criterios de diagnóstico, tales como la presunta asociación con una enfermedad. El número de marcadores elegidos se deja al criterio del usuario y depende de la capacidad predictiva acumulada de los marcadores y la especificidad/sensibilidad de los marcadores individuales en el panel. Puede elegirse un panel de marcadores para aumentar la eficacia del diagnóstico, prognóstico, respuesta al tratamiento y/o recurrencia. Además de los problemas generales en torno a la especificidad y la sensibilidad, los marcadores también pueden elegirse tomando en consideración la historia y el estilo de vida del paciente. Por ejemplo, otras enfermedades que el paciente tenga, pueda tener o haya tenido pueden afectar a la elección del panel de biomarcadores que se va a analizar. Los fármacos que el paciente tenga en su sistema también pueden afectar a la selección del panel.

La invención es aplicable al diagnóstico y el control de cualquier enfermedad, en poblaciones de pacientes sintomáticos o asintomáticos. Por ejemplo, la invención puede utilizarse para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, enfermedades hereditarias y otros trastornos, tales como una enfermedad o lesión provocada por el abuso de fármacos o alcohol. La invención también puede aplicarse a la evaluación de la eficacia terapéutica,... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar múltiples analitos en una muestra, comprendiendo dicho método las etapas de: obtener una muestra que comprende al menos un ácido nucleico diana y al menos una proteína diana; introducir un aptámero que se une a la proteína diana en la muestra; y realizar un único ensayo, en el que el ensayo detecta el ácido nucleico diana y la proteína diana, comprendiendo dicho ensayo las etapas de: retirar el aptámero no unido del complejo de aptámero-proteína; realizar una PCR con el ácido nucleico diana; realizar una PCR con el aptámero; introducir una primera sonda marcada de modo detectable que se une al ácido nucleico diana amplificado; introducir una segunda sonda marcada de modo detectable que se une al aptámero amplificado; detectar la primera sonda, detectando con ello el ácido nucleico en la muestra; y detectar la segunda sonda que está unida al aptámero amplificado, en el que la detección de la segunda sonda detecta la proteína diana.

2. El método según la reivindicación 1, que comprende además cuantificar el ácido nucleico diana.

3. El método según la reivindicación 1, que comprende además cuantificar la proteína diana.

4. El método según la reivindicación 1, que comprende además cuantificar el ácido nucleico diana y la proteína diana.

5. El método según la reivindicación 4, en el que la cuantificación comprende: realizar una PCR a tiempo real con el ácido nucleico; y realizar una PCR a tiempo real con el aptámero, en el que la cuantificación del aptámero amplificado cuantifica la proteína diana.

6. El método según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico diana está asociado con una enfermedad.

7. El método según la reivindicación 6, en el que la enfermedad es un cáncer.

8. El método según la reivindicación 6, en el que el ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en:

FGFR3, K-ras, K-ras2, APC, DCC, TP53, PRC1, NUSAPI1, CAPZ, PFKP, EVER1, FLT1, ESPL1, AKAP2, CDC45L, RAMP, SYNGR2, NDRG1, ZNF533, y un ácido nucleico hipermetilado.

9. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína diana está asociada con una enfermedad.

10. El método según la reivindicación 9, en el que la enfermedad es un cáncer.

11. El método según la reivindicación 9, en el que la proteína diana se selecciona del grupo que consiste en: MMP2, MMP-9, complejo de MMP9/NGAL, complejo de MMP/TIMP, complejo de MMP/TIMP1, ADAMTS-7, ADAM-12, timosina 15, timosina 16, profilina, prohibitina, ubiquitina, tropomiosina, Cyr61, cistatina B, y chaperonina 10.