Controles para ensayos con ácidos nucleicos.

Un método para detectar la presencia o la ausencia de una biomolécula diana en una muestra sospechosa de comprender la biomolécula diana que comprende los siguientes pasos:

a) en el que este paso consiste del paso a1) o a2)

a1) la adición de una biomolécula de control interno

- a la muestra sospechosa de comprender la biomolécula diana, y

- a una muestra de control negativo que no comprende la biomolécula diana,

- a una muestra de control positivo que comprende la biomolécula diana, y

- a una segunda muestra de control positivo que comprende la biomolécula diana a2) añadiendo una biomolécula de control interno

- a la muestra sospechosa de comprender la biomolécula diana, y

- a una muestra de control negativo que no comprende la biomolécula diana, y

- a una muestra de control positivo que comprende la biomolécula diana,

y proporcionar una segunda muestra de control positivo que comprende la biomolécula diana b) purificar las biomoléculas a partir de las muestras del paso a) para obtener muestras que comprenden las biomoléculas purificadas, en el que la muestra de control positivo, pero no la segunda muestra de control positivo se somete a dicha purificación,

c) determinar en cada muestra obtenida en el paso a) o b) la presencia o la ausencia de una señal de la biomolécula de control interno y de la biomolécula diana,

d) verificar la presencia o ausencia de la señal de la biomolécula diana en la muestra sospechosa de comprender la biomolécula diana mediante:

- la comprobación de la muestra sospechosa de comprender la biomolécula diana para la presencia de una señal para la biomolécula diana independientemente de la presencia de una señal de la biomolécula de control interno o comprobación de la presencia de una señal de la biomolécula de control interno en el caso de una ausencia de una señal para la biomolécula diana,

- la comprobación de la muestra de control negativo para la presencia de una señal de la biomolécula de control interno y por la ausencia de una señal de la biomolécula diana,

- la comprobación de la muestra de control positivo para la presencia de una señal de la biomolécula diana y por la presencia de una señal de la biomolécula de control interno, y

- la comprobación de la segunda muestra de control positivo para la presencia de una señal para la biomolécula diana en el paso d) del método o comprobación de la segunda muestra de control positivo para la presencia de una señal para la biomolécula diana y, opcionalmente, para la biomolécula de control interno,

e) detectar la presencia o la ausencia de la biomolécula diana mediante la cual la presencia o ausencia de las señales para la biomolécula diana y la biomolécula de control interno determinadas en en el paso c) y verificadas en el paso d) indican la presencia o la ausencia de la biomolécula diana en la muestra de ensayo.

Controles para ensayos con ácidos nucleicos

Campo de la invención 5

La presente invención se relaciona con un método para detectar una biomolécula diana en muestras para ensayos mediante la adición de una biomolécula de control interno a la muestra de ensayo; a una muestra de control negativo, a una muestra de control positivo y para una muestra de control de reactivo o añadiendo una biomolécula de control interno a la muestra de ensayo, a una muestra de control negativo, a una muestra de control positivo que 10 comprende la biomolécula diana y proporcionar una muestra de control de reactivo que comprende la biomolécula diana, determinando en cada muestra una señal, y la verificación de la señal para detectar de esta manera la biomolécula diana. La invención también se relaciona con un método para verificar la determinación de una señal que indica la presencia de una biomolécula diana. La invención se refiere además a un método para detectar la presencia o la ausencia de un miembro de un grupo de ácidos nucleicos diana en una muestra y un método para 15 verificar la determinación de una señal que indica la presencia de un miembro de un grupo de ácidos nucleicos diana. Del mismo modo se consideran los usos y los equipos.

Antecedentes de la invención 20

La determinación de ácidos nucleicos se ha convertido en una herramienta importante en la química analítica, sobre todo en la atención sanitaria. Por ejemplo, las enfermedades infecciosas y el estado genético pueden determinarse fácilmente sobre la base de la presencia o la cantidad de un ácido nucleico indicativa de dicha enfermedad o estado en muestras recibidas de un individuo. Por esta razón se establecieron métodos utilizando hibridación específica de secuencia de un ácido nucleico, preferiblemente un oligonucleótido, con un ácido nucleico diana indicativa de la 25 enfermedad o el estado genético. Muchos ácidos nucleicos diana están presentes en un organismo a una concentración tan baja, que no es posible una detección directa en una muestra derivada de ese organismo. Estas dianas deben ser amplificadas antes de la detección. Los métodos de amplificación adecuados son, por ejemplo LCR (patentes US nº 5.185.243, 5.679.524 y 5.573.907; PE 0 320 308; WO 90/01069; WO 89/12696; y WO 89/09835) . La tecnología de ciclación de sondas (patentes US nº 5.011.769, 5, 403, 711, 5, 660, 988, y 4, 876, 187, y las 30 solicitudes publicadas PCT WO 95/05480, WO 95/14106, WO 95/00667 y) , la tecnología InvaderTM (patentes US nº 5.846.717;. 5.614.402; 5.719.028; 5.541.311; y 5.843.669) , la tecnología de la replicasa Q-Beta (patente US nº 4.786.600) , NASBA (patentes US nº 5.409.818; PE- 0 329 822) , TMA (patentes US nº 5.399.491, 5.888.779, 5.705.365, 5.710.029) , SDA (patentes US nº 5.455.166 y 5.130.238) y PCR (US-A-4.683.202) .

Con el fin de minimizar los falsos resultados en las determinaciones de ácidos nucleicos, las autoridades de varios países requieren el uso de ácidos nucleicos control. Especialmente cuando se utilizan métodos de amplificación de ácidos nucleicos tales controles son muy importantes, ya que el proceso de amplificación puede ser fuertemente influenciado por las condiciones de reacción, lo que podría conducir a resultados engañosos. A veces en una muestra están contenidas sustancias inhibidoras, que podrían conducir a resultados falsos negativos. Una revisión 40 de los conceptos de control se proporciona en Valentine-Thon, E., J. Clinical Virol. 25 (2002) S13-S21.

En general se puede distinguir entre controles externos e internos. Los controles externos, como controles positivos y negativos clásicos imitan muestras positivas y negativas y, normalmente, se utilizan para comprobar si el ensayo se ejecuta correctamente o si contiene contaminantes. Un control interno, por ejemplo, es útil para reconocer 45 sustancias inhibidoras contenidas posiblemente en una muestra o se pueden utilizar como un estándar de cuantificación en un ensayo cuantitativo. En contraste con el control externo, que normalmente se prueba en una cámara de reacción separada, un control interno se incuba preferiblemente en la misma cámara de reacción junto con el analito a analizar. Por lo tanto, el control o el producto amplificado de este control tiene que ser distinguible del analito o del producto amplificado de ese analito. Cuando se utiliza un método de amplificación, un ácido 50 nucleico de control interno está siendo coamplificado esencialmente bajo las mismas condiciones de reacción que el ácido nucleico diana. Estas condiciones incluyen las concentraciones de reactivos, la temperatura, la concentración de inhibidor o actividades enzimáticas. Las secuencias de uso frecuente para los controles derivan de genes de mantenimiento (véase Chelly, J., et al., Eur J. Biochem 187 (1990) 691-69; Mallet, F., et al., J. Clin. Microbiol. 33 (1995) 3201-3208) , y también de secuencias no naturales (véase, por ejemplo PE 1 236 805) . 55

El ácido nucleico amplificado derivado del control interno se pueden distinguir a partir del ácido nucleico amplificado derivado del ácido nucleico diana, por ejemplo, por su longitud o diferente capacidad de hibridación a una sonda distinta (para revisiones véase: Clementi, M., et al., PCR Methods Applic. 2 (1993) 191-196; Clementi, M., et al., Arch. Virol. 140 (1995) 1523 - 1539) . En todos los casos la secuencia de nucleótidos del control interno es parcial o 60 totalmente diferente de la secuencia de ácido nucleico diana (véase también Haentjens-Herwegh, S., et al., Recent Res. Devel. Microbiology 4 (2000) 547-556) .

Uno de los aspectos más críticos en una reacción de amplificación es la unión del cebador al ácido nucleico diana. Por lo tanto están siendo utilizados controles internos, que tienen los mismos sitios de unión a cebador que el ácido 65 nucleico diana (véase, por ejemplo Gilliland, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 2725 - 2729) .

Los documentos WO 02/18635 y WO 99/06594 describen el uso de secuencias de control interno encapsuladas que imitan los ácidos nucleicos encapsulados en una cubierta de virus.

PE 1.319.716 describe el uso de varios ácidos nucleicos de control interno discriminables para el ensayo de 5 aislamiento y amplificación de ácidos nucleicos.

El documento WO 2004/055205 describe la adición de secuencias de control interno a una muestra que se somete a la preparación de muestras. A continuación, la señal de la IC se compara con controles externos que no se sometieron a la preparación de muestras a fin de verificar la eficiencia de la lisis celular y de preparación de la 10 muestra, así como el rendimiento de amplificación y/o detección del ácido nucleico.

El documento US 6.277.560 describe el uso del DNA de un microorganismo externo como estándar externo para la cuantificación y el uso de un control interno para evaluar la eficiencia de amplificación de ácidos nucleicos.

Gilliland, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 2725-2729 describe el uso de controles negativos y controles internos para la cuantificación.

Brakenhoff, R., et al., Clin. Cancer Res. 5 (1999) 725-732, describe un ensayo de PCR con un estándar interno para el control de la calidad del RNA, un estándar externo para el control de sensibilidad y un control negativo. El 20 documento WO 2005/061737 describe un equipo con un control interno, un control positivo y un control negativo.

Leushner y Kelly, Qiagennews, Nº 4, 2000, página 21, describen un método para la detección de bacterias entéricas patógenas en heces mediante PCR multiplex utilizando un control interno y un control positivo.

El equipo de detección quot;LightCycler® foodproof E. coli 0157quot; fabricado por Roche, Mannheim, Alemania, describe en su manual un método de PCR para la detección cualitativa de E. coli serotipo 0157 utilizando un control interno y un molde de control.

El documento US2003/077622 se refiere a métodos y composiciones que proporcionan un control positivo para 30 identificar la inhibición durante una reacción de amplificación de señales.

El ensayo quot;CT/NG Test para Chlamydia trachomatisquot; fabricado por Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, EE.UU., describe en su manual un método de PCR para la detección de Chlamydia trachomatis utilizando un control interno y el DNA diana de C. trachomatis. 35

El manual para el equipo de identificación de especies de carne CycleavePCRTM fabricado por Takara, Japón, describe un método para la diferenciación de diferentes especies de carne incluyendo un control.

Resumen de la invención 40

Es un objeto de la invención proporcionar nuevos conceptos para el control de métodos para la detección... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia o la ausencia de una biomolécula diana en una muestra sospechosa de comprender la biomolécula diana que comprende los siguientes pasos:

a) en el que este paso consiste del paso a1) o a2)

a1) la adición de una biomolécula de control interno

- a la muestra sospechosa de comprender la biomolécula diana, y 10

- a una muestra de control negativo que no comprende la biomolécula diana,

- a una muestra de control positivo que comprende la biomolécula diana, y

- a una segunda muestra de control positivo que comprende la biomolécula diana

a2) añadiendo una biomolécula de control interno 15

- a la muestra sospechosa de comprender la biomolécula diana, y

- a una muestra de control negativo que no comprende la biomolécula diana, y

- a una muestra de control positivo que comprende la biomolécula diana,

y proporcionar una segunda muestra de control positivo que comprende la biomolécula diana

b) purificar las biomoléculas a partir de las muestras del paso a) para obtener muestras que comprenden las biomoléculas purificadas, en el que la muestra de control positivo, pero no la segunda muestra de control positivo se somete a dicha purificación, 25

c) determinar en cada muestra obtenida en el paso a) o b) la presencia o la ausencia de una señal de la biomolécula de control interno y de la biomolécula diana,

d) verificar la presencia o ausencia de la señal de la biomolécula diana en la muestra sospechosa de comprender la 30 biomolécula diana mediante:

- la comprobación de la muestra sospechosa de comprender la biomolécula diana para la presencia de una señal para la biomolécula diana independientemente de la presencia de una señal de la biomolécula de control interno o comprobación de la presencia de una señal de la biomolécula de control interno en el caso de una 35 ausencia de una señal para la biomolécula diana,

- la comprobación de la muestra de control negativo para la presencia de una señal de la biomolécula de control interno y por la ausencia de una señal de la biomolécula diana,

- la comprobación de la muestra de control positivo para la presencia de una señal de la biomolécula diana y por la presencia de una señal de la biomolécula de control interno, y 40

- la comprobación de la segunda muestra de control positivo para la presencia de una señal para la biomolécula diana en el paso d) del método o comprobación de la segunda muestra de control positivo para la presencia de una señal para la biomolécula diana y, opcionalmente, para la biomolécula de control interno,

e) detectar la presencia o la ausencia de la biomolécula diana mediante la cual la presencia o ausencia de las 45 señales para la biomolécula diana y la biomolécula de control interno determinadas en en el paso c) y verificadas en el paso d) indican la presencia o la ausencia de la biomolécula diana en la muestra de ensayo.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la muestra de control positivo comprende un virus, un microorganismo o una célula que comprende la biomolécula diana. 50

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en el que la biomolécula diana es un grupo de biomoléculas diana.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la biomolécula es un ácido nucleico. 55

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4 en el que el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de control interno se amplifica antes del paso c) .

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 en el que la señal del ácido nucleico diana o 60 del ácido nucleico de control interno es una señal de fluorescencia.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6 en el que la señal de fluorescencia se genera por un marcador unido a una sonda que se hibrida con el ácido nucleico diana o el ácido nucleico de control interno.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, donde la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico diana es una secuencia de ácido nucleico específica para un microorganismo, una célula o un virus.

9. Un método para detectar la presencia o la ausencia de un miembro de un grupo de ácidos nucleicos diana en una muestra sospechosa de comprender el miembro de un grupo de ácidos nucleicos diana mediante: 5

a) la adición de un ácido nucleico de control interno

- a la muestra sospechosa de comprender un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana, y

- a una muestra de control negativo que no comprende un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana, y 10

- a una muestra de control positivo que comprende un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana,

b) proporcionar una segunda muestra de control positivo que comprende el grupo de los ácidos nucleicos diana y, opcionalmente, un ácido nucleico de control interno,

c) purificar los ácidos nucleicos de las muestras del paso a) y/o b) para obtener muestras que comprenden los ácidos nucleicos purificados, en el que la muestra de control positivo, pero no la segunda muestra de control positivo se somete a dicha purificación,

d) determinar en cada muestra obtenida en los pasos a) y b) o en los pasos b) y c) la presencia o ausencia de una 20 señal del ácido nucleico de control interno y de una señal de un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana,

e) verificar la presencia o la ausencia de la señal del miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana en la muestra sospechosa de comprender un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana mediante:

- la comprobación de la muestra sospechosa de comprender un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana para la presencia de una señal de un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana independientemente de la presencia de una señal del ácido nucleico de control interno o comprobación de la presencia de una señal del ácido nucleico de control interno en el caso de la ausencia de una señal de un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana, 30

- la comprobación de la muestra de control negativo para la presencia de una señal del ácido nucleico de control interno y por la ausencia de una señal del ácido nucleico diana,

- la comprobación de la segunda muestra de control positivo para la presencia de una señal de cada miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana y, opcionalmente, del ácido nucleico de control interno, y

- la comprobación de la muestra de control positivo para la presencia de una señal de un miembro del grupo 35 de los ácidos nucleicos diana y por la presencia de una señal del ácido nucleico o de control interno,

f) detectar la presencia o la ausencia de un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana mediante el cual la presencia y/o la ausencia de las señales para un miembro del grupo de los nucleico diana ácidos y el ácido nucleico de control interno determinado en el paso d) , y verificada en el paso e) indican la presencia o la ausencia de un 40 miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana en la muestra que se sospecha que comprende un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9

- en el que la biomolécula de control interno comprende una parte de la biomolécula diana,

- en el que la muestra de control positivo comprende un virus, un microorganismo o una célula que contiene la biomolécula diana o en el que la muestra de control positivo es una solución que comprende la biomolécula diana o una parte de la misma, o - en el que la segunda muestra de control positivo es una solución que comprende la biomolécula diana o una 50 parte de la misma.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10 en el que un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana y el ácido nucleico de control interno se amplifica antes del paso d) .

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la señal de un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana o del ácido nucleico de control interno es una señal de fluorescencia.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12 en el que la señal de fluorescencia se genera por un marcador unido a una sonda que se hibrida a un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana o el ácido nucleico de 60 control interno.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 en el que un miembro del grupo de los ácidos nucleicos diana comprende una secuencia de ácido nucleico específica para un microorganismo, una célula o un virus. 65

15. El uso de una segunda muestra de control positivo que comprende opcionalmente una biomolécula de control interno y una muestra de control positivo que comprende una biomolécula de control interno, las dos muestras que comprenden la biomolécula diana, para detectar la presencia o la ausencia de una biomolécula diana en una muestra sospechosa de comprender la biomolécula diana o para la verificación de la determinación de una señal que indica la presencia de una biomolécula diana, en el que la muestra de control positivo, pero no la segunda 5 muestra de control positivo se somete a pasos de purificación para la obtención de las moléculas diana contenidas en la misma.