Construcción génica y métodos para detectar compuestos antifúngicos y antitumorales.

Construcción génica y métodos para detectar compuestos antifúngicos y antitumorales.

La presente invención se refiere a una construcción génica para la amplificación de la respuesta a señales que activan la ruta de integridad celular (CWI) en Saccharomyces cerevisiae. Comprende un alelo hiperactivo de la MAPKK de esta ruta, bajo el control del promotor de un gen inducible por Rlm1, que implica la creación de un circuito de retroalimentación positiva cuya estimulación conduce a la muerte celular. La invención también se refiere a los métodos para detectar agentes que alteren la pared celular o la función de componentes de la propia ruta, lo que permite la detección de compuestos farmacológicos antifúngicos y/o antitumorales.

Construcción génica y métodos para detectar compuestos antifúngicos y

antitumorales

5 Sector de la Técnica

La presente invención se encuadra en el sector de la industria farmacéutica

biotecnológica Y, más concretamente, en programas de cribado farmacológico

para búsqueda de compuestos con actividad antifúngica o modificadora de la

señalización mediada por MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases) .

\O

Eslado de la técnica:

La epidemiología de la infección fúngica invasiva (IFI) ha cambiado en los

últimos 20 años, por lo que hoy dia las micosis se consideran enfermedades

emergentes. Su incidencia ha aumentado significativamente y la población de

1 S riesgo se ha extendido incluyendo a pacientes con diferentes enfermedades de

base tales como los que padecen un cáncer hematológico, los ingresados en

unidades de cuidados intensivos, los trasplantados de órgano sólido o aquellos

que reciben altas dosis de corticosteroides u otros inmunosupresores (Garcia

Vidal et al. , 2013. Pathogenesis of invasive fungal infections. Curr. Opin. Infec!.

20 Dis. 26, 270-276) . Además, este aumento se ha observado también en otras

poblaciones de pacientes mucho más numerosas como son los que sufren

enfermedad pulmonar obstructiva crónica. También es relevante el hecho de

que la etiología de las micosis invasivas está cambiando. Además de Gandida

albicans yAspergillus fumigatus, se están identificando como agentes causales

25 de IFI otras especies como Candida glabrata, Aspergillus terreus, Trichosporon

asahii, Fusarium spp , Scedosporium spp, Mucora/es y dematiaceos. Todas

estas especies emergentes tienen la característica común de ser mucho más

resistentes a los antifúngicos que C. albicans y A. fumigatus, lo que aumenta

la mortalidad ya de por si elevada.

30

El número actual de antifúngicos efectivos es relativamente reducido y,

contrariamente a lo que se podía esperar por analogía con lo que ocurre en el

caso de los fármacos antibacterianos que actúan sobre la pared celular, sólo

se ha comercializado hasta el momento un tipo de compuestos antifúngicos

que actúan sobre esta diana, inhibiendo la síntesis de ~-glucano: las

equinocandinas (Drew el al. , 2013. Recent advances in the treatment 01 life-

S threatening, invasive lungal infections. Expert. Opin. Pharmacother. 14, 2361

2374) . Una de las razones de la escasez de f;, rmacos antifúngicos de este tipo

probablemente sea el limitado número de procedimientos de rastreo

específicos dirigidos a esta diana, frente a la estrategia clásica de buscar

inhibidores del crecimiento fúngico de una forma general. Se han propuesto

10 algunas metodologías enfocadas a la búsqueda de antifúngicos que

específicamente actúen sobre la pared celular, como son la búsqueda de

compuestos inhibidores de GTPasas fúngicas que regulan el proceso de

mantenimiento de la integridad de la pared celular (EP0892854B1) ,

compuestos que puedan inhibir manosH-transferasas (N u O-glicosilaciones) ,

15 que son enzimas ausentes en células de mamíferos y esenciales para el

mantenimiento de la pared celular fúngica (US6153376A) , o bien inhibidores

específicos del producto de genes relacionados con esta estructura y que son

esenciales para la viabilidad fúngica como CaKRE5, CaALR1 o CaCdc24

(W00068420A2) . Se han propuesto también estrategias orientadas a la

20 valoración de la expresión de genes indicadores de la actividad de la vía de la

gtuc;, n-sintasa, como son los genes SKM1, YPS3, YKL 161C (MLP1) , MET10,

etc. (W02004057033A1) . Asimismo, se ha propuesto una metodología para

identificar compuestos que alteren la pared celular mediante la valoración de la

expresión del promotor de uno de estos genes, MLP1, en virtud de que su

25 expresión está regulada por la ruta de integridad de la pared celular (CWI , Cell

Wall Integrily) de forma dependiente del factor de transcripción Rlm1 , de

manera que cuando se induce la ruta, consecuencia de una alteración

significativa de la pared celular, este es el gen cuya expresión más se induce.

La fusión de dicho promotor al gen de resistencia al antibiótico nurseotricina

30 permite detectar la inducción de la ruta en función de la resistencia de la

levadura a dicho antibiótico (ES2303452B 1) .

Otra de las razones que podrían explicar el bajo número de inhibidores de la biogénesis de la pared celular fúngica identificados hasta el momento, podría ser precisamente la existencia del eficaz mecanismo de salvamento inducido por la ruta CWI ante condiciones que hacen peligrar a esta estructura.

Todo tipo de células, desde las procarióticas más elementales hasta las eucarióticas más complejas, utilizan rutas de transducción de señales para reconocer el ambiente que las rodea y adaptarse a él, así como para comunicarse con otras células. De especial relevancia en organismos eucariotas son las rutas en las que intervienen MAPKs (Mitogen Activafed Protein Kinases) . Estas proteín quinasas regulan procesos esenciales como son la expresión génica o la traducción, estabilidad y localización de proteínas.

No es de extrañar, por tanto, que las MAPKs jueguen un papel esencial en procesos como la embriogénesis, la proliferación y diferenciación celular, la apoptosis, la respuesta a estrés, la movilidad celular, la homeostasis metabólica, la inmunidad o la función cardiaca, o que las anormalidades en señalización por MAPKs se asocien con enfermedades humanas como la obesidad, diabetes, desórdenes neurodegenerativos, artritis reumatoide o cáncer (Kim and Choi, 2010. Pathological roles of MAPK signaling pathways in human diseases. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 396·405) .

Estas rutas, conservadas evolutivamente en eucariotas, comparten una cascada de tres protein quinasas: una MAPK quinasa quinasa (MKKK o MEKK) , una MAPK kinasa (MKK o MEK) y la propia MAPK, que se fosforHan y

activan sucesivamente en condiciones de estimulación. Una vez activadas, las MAPKs fosforilan a su vez a proteínas efectoras, por ejemplo, factores de transcripción, regulando de esta manera la expresión génica (Yang et al., 2013. MAP kinase signalling cascades and transcriptional regulation. Gene 513, 113) .

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, un organismo unicelular eucariótico,

operan 5 MAPKs: Fus3, Kss1 , Hog1 , Smk1 y Slt2, que definen 5 rutas que regulan el apareamiento, el crecimiento filamentoso, la respuesta a condiciones de estrés osmótico, la formación de las esporas y la integridad celular, respectivamente (Chen and Thorner, 2007. Function and regulation in MAPK

signaling pathways: Lessons learned lrom the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 1773, 1311-1340) . En respuesta a una agresión a la pared celular de S. cerevisiae, una estructura esencial que la protege y da lorma, se produce la estimulación de la ruta mediada por la MAPK Slt2, denominada ruta de integridad de la pared celular (CWI; revisado por Levin en 2005 -Levin, D.E., 2005. Cell wall integrity signaling in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69, 262-291-) . La activación de esta ruta dispara un mecanismo compensatorio dirigido a mantener la estabilidad de la pared celular mediante una remodelación de la misma, fundamentalmente a través de un cambio en el patrón de expresión génica, y con ello asegurar la viabilidad celular frente a dicha agresión. La MAPK 5112 es activada por las MAPKKs redundantes Mkkl y Mkk2 quienes a su vez son activadas por la MAPKKK Bckl. Bckl recibe el estimulo de la proteina kinasa C Pkcl , a su vez activada por la GTPasa Rhol en respuesta a la señal detectada por los mecanosensores de membrana Mid2 y Wscl , 2, 3. Una vez activada, SIt2 loslorila y activa al lactor de transcripción Rlml , que promueve un incremento en la transcripción de una serie de genes, entre ellos YKL 161C (MLP1) , CRH1, CWP1, SLT2 o RLM1 . Por otro lado, la pared celular no está presente en células de mamíferos, mientras que esta ruta también está conservada en hongos patógenos, como Candida albicans (Navarro-Garcia, F. el al. , 2001.

Signal transduction pathways and cell-wall construction in Candida albicans.

Med. Mycol. 39 Suppl1, 87-100) , Aspergitlus fumigalus (May, G.S el al. , 2005. Mitogen activated protein kinases 01 Aspergillus fumigalus. Med.Mycol. 43 Suppl 1, S83-S86) o Cr y plococcus neofonnans (Kozubowski, L. el al., 2009. Signalling pathways in the pathogenesis 01 Cr y plococcus. Cell Microbiol. 11, 370-380) .

En conclusión, es necesario desarrollar nuevos sistemas de búsqueda y estrategias terapéuticas para solventar estos problemas. En...

1. Construcción génica que comprende los siguientes componentes, en el orden que se indica en la dirección de transcripción de 5' a 3': -la secuencia promotora de un gen inducible por el factor de transcripción Rlm1 de la ruta de integridad celular (CWI) de Saccharomyces cerevisiae, -una secuencia de DNA cuya expresión da lugar a la proteína Mkk1 de Saccharomyces cerevisiae con una mutación que produce la modificación del aminoácido S386 por P386 en dicha proteína, según se describe en SEO ID NO: 3 y denominada Mkk1 SJ86P, y -una secuencia de terminación de la transcripción; en la que la distancia entre el extremo 3' de la secuencia promotora y el extremo 5' de la secuencia de DNA cuya expresión da lugar a la proleína Mkk1 s386P es menor o igual a 18 nucleótidos y la distancia entre el extremo 3' de la secuencia de DNA cuya expresión da lugar a la proteina Mkk1 s386Py el extremo 5' de la secuencia de terminación es menor o igual a 18 nucleótidos.

2. Construcción génica en la que la secuencia de DNA cuya expresión da lugar a la proleína Mkk1 5386P es el polinucleótido que se describe en SEO ID NO: 2, denominado MKK1s386P.

3. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en la que la secuencia promotora es la región promotora del gen YKL 161c, caracterizada por SEO ID NO: 1.

4. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la que la secuencia de terminación de la transcripción es la secuencia de terminación de gen ADHI de Saccharomyces cerevisiae, caracterizada por SEO ID NO: 4.

5. Construcción génica caraclerizada por SEO ID NO: 13.

6. Vector que contiene cualquiera de las construcciones definidas en las reivindicaciones 1-5.

7. Célula de S. cerevisiae que contiene el vector definido en la reivindicación 6.

8. Célula recombinante de S. cerevisiae que incluye en su genoma cualquiera de las construcciones definidas en las reivindicaciones 1-5.

9. Cepa de S. cerevisiae depositada en la Colección de Cultivos Tipo (CECT) 10 con el número de acceso CECT13115.

10. Método para detectar compuestos antifúngicos que alteran la pared celular fúngica que incluye los siguientes pasos: a) inocular una cantidad suficiente de una cepa de S. cerevisiae según se define en cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en medio de cultivo que contiene, en sucesivos tubos, microtubos o pocillos, concentraciones crecientes de los productos que se desea evaluar; b) incubar el medio de cultivo inoculado del paso a) ; c) determinar el crecimiento de la cepa inoculada en el paso a) ;

d) seleccionar el/los producto/s incluido/s en el medio de cultivo del paso a) en el que se detecte menor crecimiento de la cepa de S. cerevisiae definida en las reivindicaciones 7-9 con respecto a una cepa silvestre utilizada como control.

. Método para detectar compuestos antitumorales o antifúngicos inhibidores de la señalización a través de la ruta CWI que incluye los siguientes pasos: a) inocular una cantidad suficiente de una cepa de S. cerevisiae según se define en cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en medio de cultivo que contiene un compuesto que estimula la ruta CWI y, en sucesivos tubos, microtubos o pocillos, concentraciones crecientes de los productos que se desea evaluar; b) incubar el medio de cultivo inoculado del paso a) ; c) determinar el crecimiento de la cepa inoculada en el paso a) ; d) seleccionar el/los producto/s incluido/s en el medio de cultivo del paso a) en el que se detecte mayor crecimiento de la cepa de S. cerevisiae definida en las reivindicaciones 7-9 con respecto a una cepa silvestre utilizada como control.

12. Método según la reivindicación 11 en el que el compuesto estimulador de la ruta CWI del paso a) es el Rojo Congo.

13. Uso de la construcción génica, los vectores ylo las células definidas en las reivindicaciones 1-9 en la detección de compuestos antifúngicos ylo de 10 compuestos antitumorales.

14. Kit para la detección de compuestos antifúngicos ylo antitumorales que incluye las construcciones génicas, los vectores ylo las células eucariotas definidas en las reivindicaciones 1-9.