Conjugados de oligosacáridos-proteínas.

Un método de preparar un compuesto que tiene la Fórmula VIIA: **Fórmula**

en donde:

R1 se elige de hidrógeno,

hidroxilo, un grupo alquilo con 1 a 4 carbonos, opcionalmente sustituido, fosfato, sulfato, -OR7, un grupo protector, y un sacárido;

R2, R3, R4 y R5 se eligen, cada uno independientemente, de hidrógeno, sulfato, hidroxilo, -OR8, un grupo protector y un sacárido;

R6 se elige de hidrógeno, hidroxilo, carboxilo, alcoxicarbonilo, amino, amida, alquilamino, aminoalquilo, aminoxi, hidrazida, hidrazina, alquenilo opcionalmente sustituido y alquilo C2-C6 opcionalmente sustituido;

R7 y R8 se eligen, cada uno independientemente, de acetilo y un grupo alquilo con 1 a 4 carbonos opcionalmente sustituido;

y n es un número entero de 1 a 10;

que comprende:

a) tratar un compuesto que tiene la Fórmula VIIIA: **Fórmula**

en donde:

R1 a R5 son como se definen arriba;

y R9 y R10 se eligen de hidrógeno e hidroxilo, de manera que cuando uno de R9 y R10 es hidroxilo, el otro es hidrógeno;

con un compuesto que tiene la Fórmula R11R12(Sn≥O) para formar un compuesto que tiene la Fórmula IXA:

en donde:

R1 a R5 son como se definen arriba; y

R11 y R12 se eligen, cada uno independientemente, de alquilo no sustituido, o R11 y R12, tomados juntos, se eligen de alquileno no sustituido; y

b) tratar el compuesto de Fórmula IXA, opcionalmente en presencia de un haluro de metal, con un compuesto que tiene la Fórmula R6-(CH2)n-L, en donde:

R6 y n son como se definen arriba; y

L es un halógeno;

para formar el compuesto de Fórmula VIIA

Conjugados de oligosacáridos-proteínas Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. Nº 61/122.851, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

La presente divulgación se refiere generalmente a conjugados de oligosacáridos-proteínas que comprende oligosacáridos particulares, y a composiciones que comprenden dichos conjugados. La presente divulgación se refiere, además, a métodos de tratar trastornos por almacenamiento lisosomal utilizando conjugados de oligosacáridos-enzimas lisosomales.

Trastornos por almacenamiento lisosomal (LSDs -siglas en inglés) son una clase de trastornos metabólicos raros que comprenden más de cuarenta enfermedades genéticas que implican una deficiencia en la actividad de hidrolasas lisosomales. Una característica distintiva de los LSDs es la acumulación anormal de metabolitos lisosomales, lo que conduce a la formación de grandes números de lisosomas distendidos.

Los LSDs pueden ser tratados mediante la administración de la versión activa de la enzima deficiente en el sujeto, un proceso denominado terapia de reemplazo de enzimas (ERT -siglas en inglés) . La enzima de reemplazo administrada que porta un manosa-6-fosfato (M6P) terminal es absorbida por células diana a través de endocitosis mediada por un receptor de M6P independiente de cationes (CI-MPR) asociado a la superficie celular y dirigida a los lisosomas.

En general, las enzimas de reemplazo fosforiladas de manera deficiente no son internalizadas de manera eficaz por el receptor de M6P en la superficie celular y, por lo tanto, no pueden ser dirigidas a los lisosomas en donde ejercen su función. Por consiguiente, un bajo grado de fosforilación de manosa puede tener un efecto significativo y perjudicial sobre la eficacia terapéutica de una enzima de reemplazo.

Se han desarrollado métodos para incrementar el contenido en M6P de enzimas de reemplazo. Por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nº 6.534.300; 6.670.165; y 6.861.242 describen la fosforilación enzimática de residuos de manosa terminales. En otro ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 7.001.994 describe un método para el acoplamiento de oligosacáridos que comprenden M6P con glicoproteínas. Se encontró que un conjugado de la enzima lisosomal α-glucosidasa ácida (GAA-siglas en inglés) con un oligosacárido bis-M6P preparado por ese método era más eficaz en reducir glucógeno del músculo esquelético y cardíaco que GAA humana recombinante en un modelo murino de la enfermedad de Pompe, una enfermedad muscular autosómica recesiva que resulta de una deficiencia metabólica de GAA, y se caracteriza por la acumulación de glucógeno lisosomal. De manera similar, Zhu et al. describen el acoplamiento de un oligosacárido bis-M6P sintético (Fórmula A) con GAA. Zhu et al., Biochem. J. 389:619-628 (2005) . La Fórmula A fue diseñada a partir de la estructura del núcleo Man9 triantenaria natural de glicanos enlazados a N (Fórmula B) eliminando una de las ramas, acortando otra rama, y fosforilando los residuos de manosa terminales.

El conjugado resultante unido a CI-MPR con una afinidad incrementada, fue interiorizado de manera más eficaz por parte de mioblastos L6, y tenía una actividad enzimática aproximadamente normal. A pesar de este éxito, sin embargo, sigue siendo importante identificar nuevos oligosacáridos que puedan resultar en una afinidad mejorada para CI-MPR y/o una internalización celular más eficaz cuando se conjuga con enzimas lisosomales, al tiempo que se mantiene una actividad enzimática normal o casi normal. Sin embargo, la absorción mejorada sola no resultará necesariamente en un mejor resultado terapéutico. Determinadas estrategias de conjugación y oligosacáridos resultan en conjugados con una actividad enzimática menor. Por lo tanto, es deseable identificar oligosacáridos y conjugados que puedan mejorar los resultados terapéuticos para sujetos con LSDs.

Además, determinados oligosacáridos tales como los mostrados en las Fórmulas A y B pueden ser difíciles y caros de sintetizar. Además, la preparación de sacáridos β-enlazados de una manera estereoselectiva ha sido un problema difícil en la química de los hidratos de carbono. Oligosacáridos alternativos y métodos de síntesis pueden ser más prácticos para su uso a escala comercial. Existe una necesidad adicional de optimizar métodos utilizados para preparar conjugados de oligosacáridos-proteínas. En particular, para fines terapéuticos, preparaciones de conjugados no deberían ser altamente heterogéneas, ya que esto puede resultar en una función biológica inconsistente. Múltiples aspectos de los conjugados pueden afectar a la eficacia terapéutica, incluyendo los oligosacáridos y enlazadores utilizados, métodos de conjugación, métodos de purificación, y formulaciones.

Por consiguiente, determinados casos de la presente divulgación proporcionan conjugados de oligosacáridosproteínas que comprenden (1) una proteína y (2) un oligosacárido de Fórmula I:

en donde:

a = α1, 2; α1, 3; α1, 4; o α1, 6;

b = α1, 2; α1, 3; o α1, 4;

c = α1, 2; α1, 3; α1, 4; o α1, 6; y

d = α, β, o una mezcla de α y β.

Otros casos de la presente divulgación proporcionan conjugados de oligosacáridos-proteínas que comprenden (1) una proteína y (2) un oligosacárido de Fórmula II:

10 en donde:

e = α1, 2; α1, 3; α1, 4; o α1, 6 y

f = α, β, o una mezcla de α y β,

con la condición de que f = α o una mezcla de α y β cuando e = α1, 6.

15 Todavía otros casos de la presente divulgación proporcionan conjugados comprenden (1) una proteína y (2) un oligosacárido de Fórmula III: de oligosacáridos-proteínas que

en donde: g = α1, 2; α1, 3; o α1, 4; h = α1, 2; α1, 3; α1, 4; o α1, 6; e i = α, β, o una mezcla de α y β.

Casos adicionales de la presente divulgación proporcionan conjugados de oligosacáridos-proteínas que comprenden (1) una proteína y (2) un oligosacárido de Fórmula IV:

en donde: 10 j es α1, 2;

k se selecciona de α, β, y una mezcla de α y β;

x es 1, 2 ó3; y

cuando x es 2 ó 3, el enlace entre cada una de las manosas se selecciona de α1, 2; α1, 3; α1, 4; y α1, 6.

Casos adicionales proporcionan conjugados de oligosacáridos-proteínas que comprenden (1) una proteína y (2) un 15 oligosacárido de Fórmula V:

en donde: I se selecciona de α, β, y una mezcla de α y β.

Casos adicionales proporcionan conjugados de oligosacáridos-proteínas que comprenden (1) una proteína y (2) un oligosacárido de Fórmula VI:

en donde:

Rx y Ry se eligen, cada uno independientemente, de polietilenglicol y alquilo C1-C10, opcionalmente sustituido con oxo, nitro, halo, carboxilo, ciano, o alquilo inferior, y opcionalmente interrumpido con uno o más heteroátomos seleccionados de N, O o S;

z se selecciona de 0, 1, 2, 3 ó 4;

m se selecciona de α, β, y una mezcla de α y β; y

cuando y es 2, 3 ó 4, la unión entre cada una de las manosas se selecciona de α1, 2; α1, 3; α1, 4; y α1, 6.

En casos adicionales, la presente divulgación proporciona conjugados de oligosacáridos-proteínas que comprenden (1) una proteína y (2) un oligosacárido de Fórmula A.

En determinados casos, el conjugado comprende al menos 2, 3, 4 ó 5 moles de oligosacárido de la fórmula A por mol de la proteína.

En algunos casos, los conjugados de oligosacáridos-proteínas de la presente divulgación comprenden un enlazador entre los componentes oligosacárido y proteína del conjugado.

La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados de oligosacáridosproteínas de Fórmula I, II, III, IV, V o VI y una carga, agente conferidor de consistencia, desintegrante, tampón, estabilizador o excipiente. La presente divulgación proporciona, además, métodos de tratar un trastorno por 20 almacenamiento lisosomal tal como, p. ej., los descritos en la Tabla 1 infra, con un conjugado de oligosacáridoproteína de Fórmula I, II, III, IV, V o VI, o una composición farmacéutica que comprende un conjugado de oligosacárido-proteína de este tipo. El trastorno por almacenamiento lisosomal se puede elegir, p. ej., de la enfermedad de Fabr y , la enfermedad de Pompe, la enfermedad de Niemann-Pick A, la enfermedad de Niemann-Pick B y mucopolisacaridosis I. En realizaciones adicionales,... [Seguir leyendo]

1. Un método de preparar un compuesto que tiene la Fórmula VIIA:

en donde: R1 se elige de hidrógeno, hidroxilo, un grupo alquilo con 1 a 4 carbonos, opcionalmente sustituido, fosfato, sulfato, -OR7, un grupo protector, y un sacárido; R2, R3, R4 y R5 se eligen, cada uno independientemente, de hidrógeno, sulfato, hidroxilo, -OR8, un grupo protector y un sacárido;

R6 se elige de hidrógeno, hidroxilo, carboxilo, alcoxicarbonilo, amino, amida, alquilamino, aminoalquilo, aminoxi, hidrazida, hidrazina, alquenilo opcionalmente sustituido y alquilo C2-C6 opcionalmente sustituido;

R7 y R8 se eligen, cada uno independientemente, de acetilo y un grupo alquilo con 1 a 4 carbonos opcionalmente sustituido; y 15 n es un número entero de 1 a 10; que comprende:

en donde: R1 a R5 son como se definen arriba; y

R9 y R10 se eligen de hidrógeno e hidroxilo, de manera que cuando uno de R9 y R10 es hidroxilo, el otro es hidrógeno; con un compuesto que tiene la Fórmula R11R12 (Sn=O) para formar un compuesto que tiene la Fórmula IXA:

en donde: R1 a R5 son como se definen arriba; y

R11 y R12 se eligen, cada uno independientemente, de alquilo no sustituido, o R11 y R12, tomados juntos, se eligen de alquileno no sustituido; y

b) tratar el compuesto de Fórmula IXA, opcionalmente en presencia de un haluro de metal, con un compuesto que tiene la Fórmula R6- (CH2) n-L,

en donde:

R6 y n son como se definen arriba; y

L es un halógeno; para formar el compuesto de Fórmula VIIA.

2. El método de la reivindicación 1, en el que R6 es un alcoxicarbonilo.

3. El método de la reivindicación 1, en el que n es 2, 3, 4, 5 ó 6 y R6 es un alcoxi C1-C4-carbonilo.

4. El método de la reivindicación 1, en el que n es 3 y R6 es metoxicarbonilo.

5. El método de la reivindicación 1, en el que eñ compuesto de fórmula R6- (CH2) n-L es 4-bromobutirato de metilo.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el compuesto de Fórmula VIIIA se selecciona de manosa, ramnosa, idosa y altrosa opcionalmente protegida.

7. El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que el compuesto de Fórmula VIIIA es manosa 15 opcionalmente protegida.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el haluro de metal es un fluoruro de metal.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el fluoruro de metal se selecciona de fluoruro de cesio, fluoruro de sodio, fluoruro de calcio, fluoruro de magnesio, fluoruro de litio y fluoruro de potasio.

10. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa b comprende, además, hacer reaccionar el compuesto de 20 Fórmula IXA en presencia de haluro de tetraalquilamonio.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el haluro de tetraalquilamonio es yoduro de tetrabutilamonio.

12. El método de la reivindicación 1, en el que R11 y R12 son cada uno butilo, R11 y R12 son cada uno hexilo, o R11 y R12, tomados juntos, forman hexametileno.

13. El método de la reivindicación 1, en el que el compuesto de Fórmula VIIIA se selecciona de 3, 4, 6-tri-O-bencil-D25 manosa y 3-O-alil-6-O-tritil-D-manosa.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el compuesto de Fórmula VIIIA es 3-O-alil-6-O-tritil-D-manosa.

15. El método de la reivindicación 1, en el que el compuesto de Fórmula VIIIA es

16. El método de la reivindicación 1, que comprende, además, añadir secuencialmente al menos un monosacárido al 30 compuesto de Fórmula VIIA para formar un oligosacárido.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el oligosacárido es un hexasacárido.

18. El método de la reivindicación 17, en el que el hexasacárido es

19. El método de la reivindicación 1, en el que R6 es aminoxi.

20. El método de la reivindicación 1, quer comprende, además, la etapa de variar las posiciones e identidades de los grupos protectores en dicho compuesto, incluyendo añadir grupos protectores adicionales a dicho compuesto.

21. El método de la reivindicación 20, en el que el producto en dicho método es un compuesto de Fórmula