Composiciones y procedimientos de control de infestaciones de insectos en plantas.

Una planta transgénica que tiene más de un transgén para reducir o eliminar la infestación por plaga de insectos en una planta,

o una célula vegetal de la misma, en el que dicha planta o dicha célula vegetal comprende un ARNb para la supresión de un gen esencial en una plaga de insectos diana y un gen que codifica una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis que exhibe actividad biológica contra dicha plaga de insectos diana.

Composiciones y procedimientos de control de infestaciones de insectos en plantas Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, al control genético de infestaciones de plagas de insectos en plantas. Más específicamente, la presente invención se refiere a la modificación de la expresión endógena de secuencias codificantes 5 en la célula o tejido de una plaga particular de insectos en plantas. Más específicamente, la presente invención utiliza tecnologías de ADN recombinante para reprimir o inhibir postranscripcionalmente la expresión de una secuencia codificante diana en la célula de una plaga de insectos, por una o más moléculas de ARN bicatenario (ARNb) transcrito a partir de toda o una parte de una secuencia codificante diana. Por tanto, la presente invención se refiere a inhibición específica de secuencias de expresión de secuencias codificantes usando ARN bicatenario (ARNb) para lograr los niveles 10 previstos de control de plagas de insectos.

También se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aisladas y sustancialmente purificadas que incluyen secuencias de nucleótidos y construcciones de ADN recombinante que no son de origen natural para transcribir las moléculas de ARNb que suprimen o inhiben la expresión de una secuencia codificante endógena o una secuencia codificante diana en la plaga de insectos cuando se introduce en la misma. También se proporcionan plantas transgénicas que (a) contienen 15 secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas de ácidos nucleicos aisladas y sustancialmente purificadas y las construcciones de ADN recombinante que no se producen naturalmente para transcribir las moléculas de ARNb para controlar infestaciones de plagas de insectos en plantas, y (b) muestran resistencia y/o tolerancia potenciada a las infestaciones de insectos. También se describen composiciones que contienen las secuencias de nucleótidos de ARNb de la presente invención para su uso en aplicaciones tópicas sobre plantas o en el entorno de las mismas para lograr la 20 eliminación o reducción de infestación de plagas de insectos.

Antecedentes de la invención El entorno en el que los seres humanos viven está repleto de infestación de plagas. Plagas que incluyen insectos, arácnidos, crustáceos, hongos, bacterias, virus, nematodos, platelmintos, ascárides, oxiuros, anquilostomas, tenias, tripanosomas, esquistosomas, éstridos, pulgas, garrapatas, ácaros y piojos son ubicuas en el entorno humano, y se ha 25 utilizado una multitud de medios para intentar controlar infestaciones por estas plagas. Las composiciones para controlar infestaciones de plagas microscópicas tales como bacterias, hongos y virus se han proporcionado en forma de composiciones de antibiótico, composiciones antivirales y composiciones antifúngicas. Las composiciones para controlar infestaciones de plagas mayores tales como nematodos, platelminto, ascárides, oxiuros, gusanos del corazón, tenias, tripanosomas y esquistosomas han sido normalmente en forma de composiciones químicas que pueden tanto aplicarse a 30 las superficies de sustratos sobre las que se sabe que infestan las plagas, como ser ingeridas por un animal infestado en forma de pellas, polvos, comprimidos, pastas o cápsulas. La presente invención se refiere a proporcionar un medio mejorado para controlar la infestación de plagas en comparación con las composiciones conocidas en la técnica.

Los cultivos comerciales son frecuentemente las dianas de ataque de los insectos. Se ha hecho sustancial progreso en las últimas décadas hacia desarrollar procedimientos y composiciones más eficaces para controlar infestaciones de insectos 35 en plantas. Los pesticidas químicos han sido muy eficaces en erradicar infestaciones de plagas. Sin embargo, hay varias desventajas de usar agentes pesticidas químicos. Los agentes pesticidas químicos no son selectivos. Las aplicaciones de pesticidas químicos están previstas para controlar plagas de insectos que son perjudiciales para diversos cultivos y otras plantas. Sin embargo, debido a la falta de selectividad, los agentes pesticidas químicos también ejercen sus efectos sobre fauna no diana, esterilizando frecuentemente eficazmente un campo durante un periodo de tiempo sobre el que se han 40 aplicado los agentes pesticidas. Los agentes pesticidas químicos persisten en el entorno y generalmente son de metabolización lenta, si lo son. Se acumulan en la cadena alimentaria, y particularmente en especies de predadores superiores. Las acumulaciones de estos agentes pesticidas químicos produce el desarrollo de resistencia a los agentes y en especies superiores hasta la cadena evolutiva, actúan de mutágenos y/o carcinógenos causando frecuentemente modificaciones genéticas irreversibles y perjudiciales. Así, ha habido una necesidad que se sentía desde hace tiempo por 45 procedimientos respetuosos con el medioambiente para controlar o erradicar infestación de insectos sobre o en plantas, es decir, procedimientos que sean selectivos, medioambientalmente inertes, no persistentes y biodegradables, y que se ajusten bien en los esquemas de gestión de resistencia de plagas.

Las composiciones que incluyen bacterias Bacillus thuringiensis (B.t.) han estado comercialmente disponibles y se han usado como insecticidas medioambientalmente seguros y aceptables durante más de treinta años. El efecto insecticida de 50 bacterias Bt se produce como resultado de proteínas que son exclusivamente producidas por estas bacterias que no persisten en el entorno, que son altamente selectivas en cuanto a las especies diana afectadas, ejercen sus efectos solo tras la ingestión por una plaga diana, y se ha mostrado que son inofensivas para plantas y otros organismos no diana, que incluyen seres humanos. Las plantas transgénicas que contienen uno o más genes que codifican proteína de B.t. insecticida también están disponibles en la técnica y son sorprendentemente eficaces en controlar la infestación de plagas 55 de insectos. Un resultado sustancial del uso de plantas recombinantes que expresan proteínas insecticidas de Bt es una marcada disminución en la cantidad de agentes pesticidas químicos que se aplican al entorno para controlar la infestación de plagas en campos de cultivo en áreas en las que tales cultivos transgénicos se usan. La disminución en la aplicación de agentes pesticidas químicos ha producido tierras más limpias y aguas más limpias que corren de las tierras a las corrientes de alrededor, ríos, estanques y lagos. Además de estos beneficios medioambientales, ha habido un aumento perceptible en los números de insectos beneficiosos en los campos de cultivo en los que se cultivan cultivos transgénicos 5 resistentes a insectos debido a la disminución en el uso de agentes insecticidas químicos.

Se ha informado de procedimientos y composiciones antisentido en la técnica y se cree que ejercen sus efectos mediante la síntesis de una molécula de ARN monocatenario que en teoría se hibrida in vivo con una molécula de ARN de hebra codificante sustancialmente complementaria. La tecnología antisentido ha sido difícil de emplear en muchos sistemas por tres motivos principales, Primero, la secuencia antisentido expresada en la célula transformada es inestable. Segundo, la 10 inestabilidad de la secuencia antisentido expresada en la célula transformada crea concomitantemente dificultad en la administración de la secuencia a un huésped, tipo de célula o sistema biológico remoto de la célula transgénica. Tercero, las dificultades encontradas con la inestabilidad y administración de la secuencia no codificante crea dificultades en intentar proporcionar una dosis dentro de la célula recombinante que expresa la secuencia antisentido que puede modular eficazmente el nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos codificante diana. 15

Ha habido algunas mejoras en las tecnologías para modular el nivel de expresión génica dentro de una célula, tejido u organismo, y en particular, una falta de tecnologías desarrolladas para retrasar, reprimir o reducir de otro modo la expresión de genes específicos usando tecnología de ADN recombinante. Además, como consecuencia de la imprevisibilidad de estos enfoques, no están disponibles medios comercialmente viables para modular el nivel de expresión de un gen específico en un organismo eucariota o procariota. 20

Previamente se ha demostrado la inhibición mediada por ARN bicatenario de genes específicos en diversas plagas. Se han probado enfoques mediados por ARNb para el control genético en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Tabara y col., 1998, Science 282:430-431) . Tabara y col. describen un procedimiento para la administración de ARNb que participa en la generación de insectos transgénicos que expresan moléculas de ARN bicatenario... [Seguir leyendo]

1. Una planta transgénica que tiene más de un transgén para reducir o eliminar la infestación por plaga de insectos en una planta, o una célula vegetal de la misma, en el que dicha planta o dicha célula vegetal comprende un ARNb para la supresión de un gen esencial en una plaga de insectos diana y un gen que codifica una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis que exhibe actividad biológica contra dicha plaga de insectos diana. 5

2. La planta transgénica de la reivindicación 1, en la que dicha planta está seleccionada de plantas de alfalfa, eneldo, manzana, albaricoque, alcachofa, rúcula, espárrago, aguacate, plátano, cebada, judías, remolacha, mora, arándano, brécol, coles de Bruselas, repollo, colza, melón cantalupo, zanahoria, yuca, coliflor, apio, cereza, cilantro, cítrico, clementina, café, maíz, algodón, pepino, abeto Douglas, berenjena, endibia, escarola, eucalipto, hinojo, higos, calabacino, uva, pomelo, melón chino, jícama, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino taeda, mango, melón, 10 champiñón, nuez, avena, okra, cebolla, naranja, una planta decorativa, papaya, perejil, guisantes, melocotón, cacahuete, pera, pimiento, caqui, pino, piña, plátano macho, ciruelas, granada, chopo, patata, calabaza, membrillo, pino insigne, achicoria, rábano, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabacín amarillo, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, boniato, liquidámbar, mandarina, té, tabaco, tomate, césped, vid, sandía, trigo, batata y calabacín verde. 15

3. La planta transgénica de la reivindicación 1, en la que dicho gen esencial es un gen diana que codifica una proteína, cuya función prevista es seleccionada de formación de músculo, formación de la hormona juvenil, regulación de la hormona juvenil, regulación y transporte de iones, síntesis de enzimas digestivas, mantenimiento del potencial de membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de esperma, síntesis de feromonas, sensibilización a feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, desarrollo y 20 diferenciación, formación de huevos, maduración de larvas, formación de enzima digestiva, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo energético, respiración y apoptosis 4. La planta transgénica de la reivindicación 1, en la que dicha proteína insecticida de Bacillus thuringiensis está seleccionada de una Cr y 1, una Cr y 3, una TIC851, una Cr y ET70, una Cr y 22, una proteína insecticida binaria de Cr y ET33 y Cr y ET34, una proteína insecticida binaria de Cr y ET80 y Cr y ET76, una proteína insecticida binaria de 25 TIC100 y TIC101, y una proteína insecticida binaria de PS149B1.

5. La planta transgénica de la reivindicación 1, en la que dicha plaga de insectos está seleccionada de una plaga de lepidópteros, una plaga de coleópteros, una plaga de hemípteros y una plaga de dípteros.

6. La planta transgénica de la reivindicación 5, en la que dicha plaga de coleópteros está seleccionada de una especie de Diabrotica, un escarabajo de la patata de Colorado (CPB, Leptinotarsa decemlineata) , un escarabajo rojo de la 30 harina (RFB, Tribolium castaneum) ; dicha plaga de lepidópteros está seleccionada del grupo que consiste en el taladro del maíz europeo (ECB, Ostrinia nubilalis) , el gusano cortador negro (BCW, Agrotis ipsilon) , el gusano elotero (CEW, Helicoverpa zea) , el gusano cogollero (FAW, Spodoptera frugiperda) , el gorgojo del algodón (BWV, Anthonomus grandis) los gusanos de seda (Bombyx mori) y Manduca sexta; y dicha plaga de hemípteros es un parásito del genero Lygus. 35

7. La planta transgénica de la reivindicación 6, en la que dicha especie de Diabrotica está seleccionada de Diabrotica virgifera, Diabrotica barberi y Diabrotica undecimpunctata.

8. La planta transgénica de la reivindicación 2, en la que dicha infestación de plagas de insectos reducida o eliminada mejora el rendimiento de un cultivo producido a partir de dicha planta.

9. Uso de células de la planta transgénica de la reivindicación 1, que comprende un ARNb para la supresión de un gen 40 esencial en una plaga de insectos diana y un gen que codifica una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis que exhibe actividad biológica contra dicha plaga de insectos diana, en la dieta de una plaga de insectos diana en una cantidad inhibidora de la plaga de insectos.

10. El uso de la reivindicación 9, en el que dichas células son seleccionadas de una célula vegetal, una pluralidad de células vegetales, un tejido vegetal, una raíz de planta, una semilla de planta y una planta cultivada a partir de 45 una semilla de planta, en el que dicha dieta comprende una cantidad inhibidora de plagas de insectos de dicho ARNb y dicha proteína insecticida de Bacillus thuringiensis.

11. Un cultivo cosechado de un campo que comprende la planta transgénica de la reivindicación 2, en el que dicho cultivo comprende dicho ARNb y dicha proteína insecticida de Bacillus thuringiensis.

12. Semilla producido a partir de la planta transgénica de la reivindicación 8, en la que dicha semilla comprende una 50 cantidad detectable de un gen que codifica dicho ARNb y dicha proteína insecticida de Bacillus thuringiensis.

13. Una materia prima o producto de materia prima seleccionado de comidas, granos o semillas triturados o enteros de una planta, o cualquier producto alimentario que comprende cualquier comida, o grano triturado o entero de la planta recombinante o semilla de la cosecha de la reivindicación 11, en el que dicha materia prima o producto de materia prima comprende una cantidad detectable de un gen que codifica dicho ARNb y dicha proteína insecticida de Bacillus thuringiensis.

14. La semilla de la reivindicación 12, en la que dicho ARNb se encuentra en las células de dicha semilla y dicha 5 semilla comprende un tratamiento de semillas.