Composiciones inmunogénicas en forma particulada y métodos para producir las mismas.

Una composición inmunogénica en forma particulada, que comprende:

i. una partícula tipo bacteria no viable (BLP) obtenida a partir de una bacteria Gram-positiva como portador particulado;

ii. oligómeros de un polipéptido producido de manera recombinante unido no-covalentemente a dicha BLP, en donde el polipéptido recombinante comprende:

A) un dominio antigénico N- o C-terminal, que comprende al menos un polipéptido expuesto en la superficie de origen patogénico o tumoral, o la parte antigénica de este, el dominio antigénico se fusiona a

B) un dominio de oligomerización (OMD), dicho dominio de oligomerización se fusiona a través de

C) un dominio enlazador a

D) un dominio de unión de péptidoglicano (PBD) consistente de una copia única de un dominio LysM que media la unión no-covalente del polipéptido a la BLP, y en donde el polipéptido en su conjunto contiene solamente una copia única de un dominio LysM; y

iii. un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Descripción Composiciones inmunogénicas en forma particulada y métodos para producir las mismas La invención se relaciona con el campo de la inmunología y el desarrollo de vacunas, particularmente con el desarrollo de vacunas basadas en oligómeros antígenos nativos.

Muchas proteínas expuestas en la superficie de patógenos y células tumorales son funcionales como oligómeros. Ejemplos de patógenos son, por ejemplo, la hemaglutinina del virus de la influenza (HA) que se produce en los viriones como homotrímero, y la neuraminidasa (NA) como un homotetrámero. Además, las glicoproteínas gp140/gp120 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) son un homotrímero en su forma activa. Asimismo, las glicoproteínas G y F del virus respiratorio sincitial (RSV) se producen en los viriones como homooligómeros tetraméricos y triméricos, respectivamente. Asimismo, las puntas del coronavirus consisten de homotrímeros como es el caso para los coronavirus respiratorio humano y coronavirus SARS. Los ejemplos para las células tumorales son, por ejemplo, los receptores tirosina cinasa (RTKs) . Los RTKs son receptores de superficie celular de alta afinidad para muchos factores de crecimiento polipeptídicos, citocinas y hormonas. Los receptores de los factores de crecimiento incluyen: receptor del factor de crecimiento epidérmico, receptores del factor de crecimiento de fibroblastos y receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas. Los receptores de las hormonas incluyen: receptor de andrógeno y receptor de estrógeno. Un ejemplo de receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es la familia de proteínas ErbB de cuatro RTKs estructuralmente relacionados. Los cuatro miembros de la familia de proteína ErbB son capaces de formar homodímeros, heterodímeros, y posiblemente oligómeros de orden superior tras la activación por un subconjunto de ligandos potenciales del factor de crecimiento. ErbB-1 se sobre expresa en muchos cánceres. La familia del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) consiste de PDGF-A, -B, -C y -D, que forman ya sea homo o heterodímeros (PDGF-AA, -AB, -BB, -CC, -DD) . Los cuatro PDGFs son inactivos en sus formas monoméricas. Tales proteínas oligoméricas de patógenos y células tumorales frecuentemente están involucradas en la patogenicidad y la inmunogenicidad de la entidad causante de la enfermedad (virus, bacterias, parásitos) o en el desarrollo del cáncer, respectivamente, y son por lo tanto objetivos importantes para el desarrollo de vacunas.

Sin embargo, durante la preparación de la vacuna la integridad y, por lo tanto, la antigenicidad de estas estructuras oligoméricas puede verse afectada negativamente por ejemplo si el proceso de fabricación implica la inactivación del patógeno. Alternativamente, el estado oligomérico del antígeno puede no obtenerse debido al proceso de producción usado para la fabricación (recombinante) de vacunas de subunidades. En ambos casos, esto puede resultar en la agregación o disociación en un estado monomérico y/o mal plegado de las proteínas.

Los epítopos conformacionales incrustados en las estructuras cuaternarias de oligómeros pueden contribuir críticamente a la inmunogenicidad (Weldon y otros PLoS One 5 [2010], pii: e12466) . Du y otros (Virology 395 [2009], 33-44) por ejemplo, encontraron que la inmunización de conejos no proporcionó evidencia de que construcciones de gp140 trimerizadas indujeran de manera significativa el aumento de anticuerpos neutralizantes contra varios pseudoviruses VIH-1, en comparación con la gp140 que carece de un motivo de trimerización. Por otra parte, Grundner y otros (Virology 331 [2005], 33-46) mostraron que la inmunización de conejos con el trímero de gp140 provocaron anticuerpos neutralizantes de mayor potencia y amplitud que lo que hicieron ya sea gp120 o proteoliposomas en fase sólida que contenían un Env de escisión defectuoso. Además Wei y otros (J. Virol. 82 [2008], 6200-6208) demostraron que puntas virales triméricas sirven como proteínas inmunógenas óptimas para provocar anticuerpos neutralizantes contra aislados del virus H5N1. En otras notas, Bosch y otros (J. Virol. 84 [2010], 10366-10374) proporcionaron evidencias de que la combinación HA trimérica soluble y NA tetramérica del virus de la influenza A (H1N1) de origen de la pandemia porcina de 2009 en presencia de adyuvante proporciona protección contra la infección en hurones.

Por lo tanto, es concebible que la presencia de antígenos proteínas oligoméricas nativas en las vacunas es fundamental para su capacidad protectora. En muchos casos, la oligomerización está determinada por un subdominio que tiene fuertes propiedades de oligomerización. Además en muchos casos, tal dominio de oligomerización de los antígenos de la vacuna está incrustado en una membrana. Para posibilitar la oligomerización de subunidades de antígenos de la vacuna en ausencia de un entorno de lípidos, subdominios de oligomerización nativos se pueden sustituir por un motivo de espiral enrollada heterólogo con propiedades que inducen conformación similar. Ejemplos de tales motivos que se aplicaron con éxito para obtener estructuras de proteínas oligoméricas nativas son una forma del factor de transcripción GCN4 de 32 aminoácidos (GCN) , un dominio de trimerización de 27 aminoácidos del C-terminal de fibritina del bacteriófago T4 (T4F) , y un dominio de trimerización soluble de proteína de la matriz del cartílago de pollo (CART) (Selvarajah y otros, AIDS Res. Hum. Retrovir. 24 [2008] 301-314; Yang y otros, J. Virol. 74 [2000], 5716-5725; Yang y otros, J. Virol. 76 [2002], 4634-4642) .

Por lo tanto, la tecnología para producir antígenos de vacunas de subunidades oligoméricas nativas está disponible. No obstante, se conoce que antígenos de vacunas de subunidades solubles son poco inmunogénicos generalmente y necesitan adyuvantes y/o un sistema de portador particulado con el fin de aumentar las respuestas inmunes robustas. En el pasado

reciente hubo un interés creciente en el desarrollo de nuevos sistemas de presentación de antígeno no replicante con el fin de aumentar la inmunogenicidad de antígenos que se podrían usar como vacunas. Muchos de estos sistemas están diseñados de tal manera para presentar el antígeno como una estructura particulada polivalente. Algunos de los ejemplos bien apreciados son las de las proteínas del núcleo y de superficie del virus de la hepatitis B genéticamente fusionado a los antígenos del virus de la fiebre aftosa (FMDV) (Clarke y otros, Nature 330 [1987], 381-384) y el VIH (Michel y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 [1988], 7957-7961; Schlienger y otros, J. Virol. 66 [1992], 2570-2576) ; el desarrollo de partículas tipo virus Ty (VLPs) como portadores de antígenos (Adams y otros, Nature 329 [1987], 68-70) donde los antígenos se fusionan genéticamente al C -terminal de la proteína codificada por el gen TYA del retro-transposón Ty de levadura para formar híbridos Ty-VLPs, partículas tipo parvovirus (Miyamura y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 91 [1994], 8507-8511) . Estas tecnologías aseguran que el antígeno en cuestión se presenta en múltiples copias en partículas relativamente grandes.

Otros portadores particulados para antígenos conocidos son los virosomas que son complejos compuestos de lípidos y al menos una proteína de la envoltura viral, producidos por un procedimiento in vitro. Los lípidos se purifican ya sea a partir de huevos o plantas o se producen de manera sintética, y una fracción de lípidos se origina a partir del virus que proporciona la proteína de la envoltura. Prácticamente, los virosomas representan envolturas de virus vacías, reconstituidas, desprovistas de la nucleocápside que incluye el material genético del virus (es) fuente. Los virosomas no son capaces de replicarse pero son vesículas de fusión activas, puras. Virosomas conocidos para usar como portador de antígeno incluyen los virosomas denominados virosomas de la influenza reconstituidos inmunopotenciadores (IRIVs) . Los IRIVs son vesículas unilamelares esféricas con un diámetro medio de 150 nm y comprenden una doble membrana lipídica, que consiste prácticamente en fosfolípidos, preferentemente fosfatidilcolinas (PC) y fosfatidiletanolaminas (PE) . Los IRIVs pueden contener las glicoproteínas de la envoltura viral funcionales HA y NA intercaladas en la membrana bicapa de fosfolípidos. La HA biológicamente activa no solamente confiere estabilidad estructural y homogeneidad a las formulaciones de virosomas sino que además contribuye de manera significativa a las propiedades inmunológicas al mantener la actividad de fusión de un virus.

Aunque estas tecnologías conocidas pueden proporcionar portadores particulados que mejoran las propiedades inmunológicas... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunogénica en forma particulada, que comprende:

i. una partícula tipo bacteria no viable (BLP) obtenida a partir de una bacteria Gram-positiva como portador particulado;

ii. oligómeros de un polipéptido producido de manera recombinante unido no-covalentemente a dicha BLP, en donde el polipéptido recombinante comprende: A) un dominio antigénico N-o C-terminal, que comprende al menos un polipéptido expuesto en la superficie de origen patogénico o tumoral, o la parte antigénica de este, el dominio antigénico se fusiona a B) un dominio de oligomerización (OMD) , dicho dominio de oligomerización se fusiona a través de C) un dominio enlazador a D) un dominio de unión de péptidoglicano (PBD) consistente de una copia única de un dominio LysM que media la unión no-covalente del polipéptido a la BLP, y en donde el polipéptido en su conjunto contiene solamente una copia única de un dominio LysM; y iii. un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. Composiciones inmunogénicas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido expuesto en la superficie en el dominio antigénico de dicho polipéptido recombinante comprende un ectodominio de una proteína de cubierta de virus, preferentemente en donde dicho virus es el virus de la influenza, coronavirus animal, coronavirus respiratorios humanos, virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) , o paramixovirus, en particular virus respiratorio sincitial (RSV) o metapneumovirus.

3. Composiciones inmunogénicas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el polipéptido expuesto en la superficie o la parte antigénica de este se selecciona del grupo que consiste del ectodominio de la hemaglutinina (HA) de la influenza o parte de este, el ectodominio de la neuraminidasa (NA) de la influenza o parte de este, el ectodominio de la proteína de la punta del coronavirus (S) o parte de este, ectodominios de las glicoproteína F o G de RSV o partes de estos y el ectodominio de la gp 140 del HIV o parte de este.

4. Composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho dominio enlazador de dicho polipéptido recombinante consiste de entre 10 y 60, preferentement.

2. 50, con mayor preferenci.

2. 40 aminoácidos, por ejemplo aproximadamente 30 aminoácidos.

5. Composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el dominio enlazador comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de :

GASSAGNTNSGGSTTTITNNNSGTNSSST, GSASSTNSGGSNNSASTTPTTSVTPAKPTSQ y QSAAASNPSTGSGSTATNNSNSTSSNSNAS.

6. Composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el dominio de oligomerización (OMD) de dicho polipéptido recombinante es un dominio de dimerización, trimerización o tetramerización, preferentemente en donde dicho dominio de oligomerización se selecciona de dominio de di-, tri-o tetramerización basado en GCN4, secuencia del dominio C-terminal de T4 fibritina (foldon) o parte funcional o análogo de este (residuos 27 a 30 C-terminales) y el dominio de trimerización soluble de la proteína de la matriz de cartílago de pollo (CART) .

7. Composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el polipéptido recombinante además comprende, en el caso de un dominio antigénico N-terminal una secuencia de cubierta Cterminal, o en el caso de un dominio antigénico C-terminal una secuencia de cubierta N-terminal.

8. Composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha bacteria es una bacteria no patogénica, preferentemente una bacteria de calidad-alimentaria, con mayor preferencia en donde dicha bacteria se selecciona del grupo que consiste de un Lactococcus, un Lactobacillus, un Bacillus y un Mycobacterium ssp.

9. Composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el portador particulado se proporciona no-covalentemente con al menos un primer oligómero de polipéptidos que comprende polipéptidos expuestos en la superficie o partes antigénicas de estos derivadas de un primer patógeno y un

segundo oligómero de polipéptidos que comprende polipéptidos expuestos en la superficie o partes antigénicas de estos derivadas de un segundo patógeno.

10. Método para proporcionar una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,

que comprenden las etapas de: a) proporcionar un polipéptido recombinante como se narró en cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende cultivar una célula huésped que comprende un vector de expresión que codifica dicho polipéptido en un medio adecuado que permita la expresión del polipéptido, y aislar el polipéptido; b) proporcionar una partícula tipo bacteria no viable (BLP) obtenida de bacterias Gram-positivas. c) permitir la unión no-covalente de dichos polipéptido (s) a dicho BLP para formar un complejo inmunogénico que comprende oligómeros de un polipéptido expuesto en la superficie de origen patogénico o partes antigénicas de este unido no-covalentemente a un portador particulado, y d) formular el complejo inmunogénico en una composición inmunogénica.

11. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para usar en un método para provocar una respuesta inmune contra un patógeno en un individuo que comprende administrar dicha composición a dicho individuo.

12. Composición inmunogénica para usar de acuerdo con la reivindicación 11, para provocar una respuesta inmune contra una enfermedad viral en un individuo, preferentemente en donde la causa de la enfermedad viral es el virus de la influenza, el coronavirus animal, coronavirus respiratorios humanos, virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) , o paramixovirus, en particular el virus sincitial respiratorio (RSV) o el metapneumovirus.

13. Un polipéptido recombinante que comprende:

A) un dominio antigénico N-o C-terminal, que comprende al menos un polipéptido expuesto en la superficie (por ejemplo de origen patogénico o tumoral) o una parte antigénica de este, el dominio antigénico se fusiona a B) un dominio de oligomerización (OMD) , dicho dominio de oligomerización se fusiona a través C) un dominio enlazador a D) un dominio de unión de péptidoglicano (PBD) consistente de una única copia de un dominio LysM capaz de mediar la unión no covalente del polipéptido a una partícula portadora de péptidoglicano que es una partícula tipo bacteria (BLP) no viable obtenida de una bacteria Gram-positiva, y en donde el polipéptido en su conjunto contiene solamente una única copia de un dominio LysM.

14. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 13.

15. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 14.

16. Una célula huésped, que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 14 o un vector de acuerdo con la reivindicación 15, preferentemente en donde dicha célula huésped es una célula huésped eucariótica, con mayor preferencia una célula huésped de mamífero.