Enzima de degradación de la pared celular fúngica.

Polipéptido fúngico que tiene actividad de lisozima y pertenece a la familia GH25 seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos, que tiene al menos 80% de identidad con los aminoácidos 1 a 233 de SEC ID nº: 2;

(b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones de astringencia altas con una sonda polinucleótida que está constituida por la cadena complementaria de los nucleótidos 84 a 782 de SEC ID nº: 1 o

(c) un fragmento de (a) o de (b) que tiene actividad de lisozima;

donde el polipéptido tiene un pH óptimo a pH5.

Enzima de degradación de la pared celular fúngica Campo de invención

[1] La presente invención se refiere a una enzima fúngica con actividad de lisozima, una secuencia de nucleótidos que codifica la lisozima, un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos, métodos de producción de la lisozima, al igual que los usos de la lisozima.

Antecedentes de la invención

[2] La lisozima es una O-glicosil hidrolasa producida como un mecanismo de defensa contra las bacterias por muchos organismos. La enzima causa la hidrólisis de las paredes celulares bacterianas por escisión de los enlaces gllcosídlcos de peptidoglicano, una molécula estructural Importante en las bacterias. Después de tener sus paredes celulares debilitadas por la acción de la lisozima, las células bacterianas se alisan como resultado de la presión osmótica.

[3] La lisozima se produce en muchos organismos tales como los virus, las plantas, los insectos, los pájaros, los reptiles y los mamíferos. En mamíferos, la lisozima se ha aislado a partir de secreciones nasales, saliva, lágrimas, intestinos, orina y leche. La enzima escinde el enlace glicosídlco entre número de carbono 1 de ácido N-acetilmurámico y número de carbono 4 de N-acetil-D-glucosamina. In vivo, estos dos carbohidratos se polimerizan para formar el polisacárido de la pared celular.

[4] La purificación y las propiedades de las enzimas líricas a partir de filtrados de cultivo crudos de Chalaropsis fue publicada por JJ.H. Hash (1963), Archives Biochem. Biophy. 12, 379-388 y fue purificada por J.H. Hashy M.V. Rothlauf (1967), J. Biol. Chem. 242:23, 5586-559. La secuencia de la lisozima Ch de Chalaropsis se ha descrito en Felch et al. (1975), J. Biol. Chem. 25(1), págs. 3713-372. Bacterias contra las que la lisozima ha mostrado eficacia Incluyen Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, Clostridium tyrobutyricum, Listeria monocytogenes.

[5] La acción lírica de la proteína de lisozima de la clara de huevo se está aprovechando actualmente en dos mercados.

[6] En la producción de queso, se ha descubierto que la lisozima es eficazmente destructiva en las formas vegetativas de bacterias de Clostridia y específicamente Clostridium tyrobutyricum. Se ha descubierto que estas bacterias sobreviven al tratamiento térmico normal de la leche usado en la producción de queso y más tarde se propagan para provocar un hinchamiento tardío. El hlnchamlento tardío es la formación de gases durante la fermentación butírica que se producen durante la maduración del queso. Los efectos de la formación de gases indeseados pueden ser: fallos en la textura a través del desarrollo de ojos con formas Irregulares o gustos y olores Indeseables obvios y,finalmente, el bloque de queso se puede romper completamente. Con el uso de lisozima en el cultivo de leche, la producción y el curado del queso se puede realizar sin preocuparse por la fermentación butírica que causa los efectos de hinchamiento tardío. Esto ha llevado al amplio uso de la lisozima en la producción de queso europeo, particularmente en la producción de queso semicurado y curado. La dosificación recomendada es de ,2 lbs/1. galones de leche (que corresponde a aproximadamente 24 g/1. litros de leche). La lisozima se debe añadir después del tratamiento térmico debido a la inestabilidad térmica y lo antes posible antes de añadir el cuajo debido a la sensibilidad de la proteasa.

[7] En farmacología, la función natural de la lisozima en los líquidos biológicos es atacar las bacterias extrañas al cuerpo. Muchas bacterias que invaden el cuerpo a través de cualquier vía típica como los ojos, la boca, la nariz y las heridas son combatidas con el sistema inmunológlco humano, del que la lisozima es una parte crítica. Esta actividad anri-infecciosa se ha explotado en la industria farmacológica mediante la producción de comprimidos y cápsulas farmacéuticos que contienen esta proteína derivada de la clara de huevo. También es un componente importante en las gotas para los ojos, la pasta dental y pastillas para la garganta. Los usos potenciales para la lisozima son variados. Se han determinado resultados satisfactorios en la investigación del cáncer y en aplicaciones veterinarias. Como conservante alimenticio, la lisozima es una alternativa orgánica natural para muchos carcinógenos potenciales. El uso de la lisozima en las aplicaciones de alimento para bebés así como en el pienso para animales ha mostrado resultados positivos. El potencial para esta enzima derivada de la clara de huevo es diverso e la investigación y el desarrollo en aplicaciones futuras está en marcha.

[8] Se ha Informado de una lisozima GH25 de Chalaropsis (Felsch JW, Ingagami T y Hash JH. (1975) The N,- Dlacetylmuramidase of Chalaropsis species; V The complete amino acid sequence. JBC. 25:1 pp 3713-372).

[9] La lisozima de clara de huevo de gallina que es el producto primario disponible en el mercado comercial, no escinde N,6--d¡acet¡lmuram¡dasa en, por ejemplo, las paredes celulares de Streptococcus aureus y así es incapaz de lisar este importante patógeno humano entre otros.

[1] Por lo tanto se desean nuevos polipéptidos que tengan actividad de lisozima.

Resumen de la invención

[11] Los inventores de la presente invención han aislado un gen/ADNc fúngico que codifica una enzima que tiene actividad de lisozima. Tal gen/ADNc que codifica la enzima no se ha descrito previamente, que nosotros sepamos.

[12] En un primer aspecto, la presente invención por lo tanto se refiere a un polipéptido fúngico que tiene actividad de lisozima y que pertenece a la familia GH25 seleccionada del grupo que consistente en:

(a) un polipéptido que Incluye una secuencia de aminoácidos, que tiene al menos 8% de identidad con los aminoácidos 1 a 233 de SEC ID n°: 2;

(b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones de astringencia altas con una sonda polinucleótida que consiste en la cadena complementaria de los nucleótidos 84 a

782 de SEC ID n°: 1; o

(c) un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad de lisozima; donde el polipéptido tiene un pH óptimo en pH 5.

[13] En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención. La presente invención se refiere además a métodos para producir polipéptidos de la invención y al uso de polipéptidos de la invención como un inhibidor de la formación de biopelícula, en una composición dental, en una composición de detergente o en el pienso para animales.

Definiciones

[14] Antes de discutir las formas de realización detalladas de la invención, se proporciona una definición de los términos específicos relacionada con los aspectos principales de la invención.

[15] Abreviaturas: GIcNAc, N-acetilglucosamina; MurNAc, ácido N-acetilmurámico.

[16] Polipéptido sustancialmente puro: en el presente contexto, el término "polipéptido sustancialmente puro" se refiere a una preparación de polipéptido que contiene a lo sumo 1% en peso de otro material de polipéptido con el cual está originalmente asociado (porcentajes inferiores de otro material de polipéptido se prefieren, por ejemplo a lo sumo 8% en peso, a lo sumo 6% en peso, a lo sumo 5% en peso, a lo sumo 4%, a lo sumo 3% en peso, a lo sumo 2% en peso, a lo sumo 1% en peso, y a lo sumo Ví% en peso). Así, se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea al menos 92% puro, es decir que el polipéptido constituya al menos 92% en peso del material de polipéptido total presente en la preparación, y se prefieren porcentajes más altos tales como al menos 94% puro, al menos 95% puro, al menos 96% puro, al menos 96% puro, al menos 97% puro, al menos 98% puro, al menos 99% puro y al menos 99,5% puro. Los polipéptidos que se describen aquí están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos que se describen aquí estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación de polipéptido esté esencialmente libre de otro material de polipéptido con el cual esté originalmente asociado. Esto se puede conseguir, por ejemplo, preparando el polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos. Aquí, el término "polipéptido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos "polipéptido aislado" y "polipéptido en forma aislada".

[17] Actividad de lisozima: el término actividad de lisozima se define aquí como una O-glicosil hidrolasa, que cataliza la hidrólisis del enlace glicosídico entre dos o más carbohidratos, o entre un carbohidrato y una fracción no carbohidrato. Las lisozimas escinden... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido fúngico que tiene actividad de lisozima y pertenece a la familia GH25 seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos, que tiene al menos 8% de identidad con los aminoácidos 1 a 233 de SEC ID n°: 2;

(b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones de astringencia altas con una sonda polinucleótida que está constituida por la cadena complementaria de los nucleótidos 84 a 782 de SEC ID n°: 1 o

(c) un fragmento de (a) o de (b) que tiene actividad de lisozima; donde el polipéptido tiene un pH óptimo a pH5.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que incluye una secuencia de aminoácidos, que tiene al menos 85% de identidad con los aminoácidos 1 a 233 de SEC ID n°: 2.

3. Polipéptido según la reivindicación 2, que comprende los aminoácidos 1 a 233 de SEC ID n°: 2.

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que consiste en los aminoácidos 1 a 233 de SEC ID n°: 2.

5. Polipéptido según la reivindicación 1, que se codifica por una secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones de astringencia muy altas con una sonda polinucleótida constituida por la cadena complementaria de los nucleótidos 84 a 782 de SEC ID n°: 1.

6. Polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 6 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

8. Vector de expresión recomblnante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 7.

9. Célula huésped recomblnante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 7.

1. Método para producir un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende:

(a) cultivo de una cepa, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido, para producir el polipéptido; y

(b) recuperación del polipéptido.

11. Método para producir un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende:

(a) cultivo de una célula huésped recombinante tal y como se define en la reivindicación 9, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y

(b) recuperación del polipéptido.

12. Polinucleótido según la reivindicación 6 que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85% de identidad con los nucleótidos 84 a 782 de SEC ID n°: 1.

13. Polinucleótido según la reivindicación 12, que tiene al menos 9% de identidad con los nucleótidos 84 a 782 de SEC ID n°: 1.

14. Polinucleótido que comprende la SEC ID n°: 1.

15. Polinucleótido que consiste en la SEC ID n°: 1.

16. Polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de lisozima, y que hibridiza bajo condiciones de astringencia altas con una sonda polinucleótida que consiste en la cadena complementaria de los nucleótidos 84 a 782 de SEC ID n°: 1.

17. Polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos modificada que comprende al menos una modificación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n°: 1, y donde la secuencia de nucleótidos modificada codifica un polipéptido que consiste en los aminoácidos 1 a 233 de SEC ID n°: 2.

18. Método de redistribución de un ADN que comprende el uso del polinucleótido tal y como se define en cualquiera de

las reivindicaciones 6 y 12-17.

19. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 como un inhibidor de formación de biopelícula.

2. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en una composición dental.

21. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en una composición de detergente.

22. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en el pienso para animales.