Composiciones y métodos para detección de infección patógena.

La presente invención trata en general se caracteriza por composiciones y procedimientos terapéuticos y diagnósticos para incrementar o disminuir la unión de un polipéptido de lisozima a un polipéptido P17 de Treponema pallidum (TP17) o a polipéptidos similares a Tp17.

Más particularmente, la invención trata de composiciones y procedimientos para detectar, tratar o prevenir una infección patógena o alteraciones crónicas; y de ensayos de unión que usan polipéptidos similares a Tp17 y polipéptidos de lisozima.

Composiciones y métodos para detección de infección patógena

Campo de la invención La presente invención presenta en general composiciones y métodos de diagnóstico derivados de la caracterización de la unión de un polipéptido de lisozima con un polipéptido P17 de Treponema pallidum (Tp17) o polipéptidos de tipo Tp17. Además, la invención proporciona métodos y composiciones para aumentar o reducir la unión entre una lisozima y un TP-17 o un polipéptido de tipo TP-17.

Antecedentes de la invención La sífilis es una enfermedad provocada por infección por Treponema pallidum (denominado en lo sucesivo en el presente documento también “Tp”) . El diagnóstico de la sífilis se realiza en general por un inmunoensayo de anticuerpo anti-Tp en la sangre usando, por ejemplo, el ensayo de Hemaglutinación de Treponema pallidum (TPHA) , el Ensayo de Absorción de Anticuerpo de Treponema Fluorescente (FTA-ABS) y/o el Ensayo de Inmovilización de Treponema pallidum (TPI) , así como sistemas de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y transferencia de western. Estos ensayos detectan anticuerpos que reaccionan con Tp o preparaciones de antígeno de Tp, tales como los antígenos de Tp, Tp15, Tp17 y Tp47, por ejemplo. El ensayo de TPI implica una evaluación microscópica del grado en que los anticuerpos activadores de complemento en el suero de un paciente inhiben la movilidad de Tp. Este ensayo no se usa en general como un diagnóstico debido a su alto coste. El ensayo de TPHA implica aglutinación de anticuerpos de suero del paciente con eritrocitos a los que se une el antígeno sonicado de Tp. El ensayo de FTA-ABS implica microscopía de inmunofluorescencia indirecta para detectar la unión de anticuerpos específicos en el suero del paciente con Tp unido a un soporte sólido mediante un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. Aunque estos ensayos se usan ampliamente, carecen de la sensibilidad requerida para detectar infección de etapa temprana o nivel bajo, cuando los niveles de anticuerpo de Tp en los fluidos corporales son muy bajos.

Además, el uso popular de antígenos de Tp purificados o recombinantes individuales en inmunoensayos existentes para sífilis no explica la unión de algunos anticuerpos con complejos formados entre antígenos de Tp y otros antígenos (es decir, compañeros de unión de antígeno de Tp) normalmente presentes en el fluido corporal del sujeto. Por lo tanto los inmunoensayos existentes no detectan tales anticuerpos en ausencia del compañero de unión de antígeno de Tp, lo que da como resultado en algunos casos baja sensibilidad o resultados de ensayo de falso negativo. Existe por lo tanto la necesidad de ensayos de diagnóstico de patógenos con sensibilidad mejorada, que detecten anticuerpos que se unen a complejos de compañero de unión/antígeno patógeno.

Sumario de la invención La invención proporciona composiciones y métodos para la detección de una infección por patógeno. La invención se refiere en general al descubrimiento de que el polipéptido de Treponema pallidum, Tp17, se une a lisozima, un péptido antimicrobiano producido por el hospedador, e inhibe la actividad antimicrobiana de la lisozima. Se identificaron el sitio de unión en Tp17 para lisozima y el sitio de unión en lisozima para Tp17. Las comparaciones de secuencias de Tp17 requeridas para la unión e inhibición de lisozima con proteínas relacionadas posibilitaron la identificación de secuencias consenso de unión a lisozimas que están conservadas entre muchos patógenos diferentes, incluyendo virus de herpes simple, lo que sugiere que la unión del polipéptido relacionado con Tp17 con lisozima proporciona un mecanismo general para inhibir una respuesta inmune del hospedador. En consecuencia, la invención también posibilita la identificación de polipéptidos de lisozimas mutantes que contienen mutaciones que interfieren con o desestabilizan la unión de TP17. Tales polipéptidos, o fragmentos de los mismos, son útiles en la prevención o tratamiento de una infección patógena. Además, la invención posibilita ensayos de diagnóstico mejorados basados en la detección de anticuerpos que se unen a un complejo de Tp17-lisozima.

La identificación de un motivo de unión a lisozima en Tp17, así como la identificación de secuencias consenso de motivo de unión a lisozimas compartidas por otras proteínas derivadas de patógenos, también proporciona composiciones y métodos útiles para la detección o inhibición de lisozima, así como la detección de patógenos específicos e inhibición de las infecciones correspondientes además de sífilis. Además, los polipéptidos derivados de patógeno son útiles en el diagnóstico, profilaxis y tratamiento de varias enfermedades, incluyendo enfermedades relacionadas con actividad lisozima aberrante. Esos polipéptidos también proporcionan un marcador de afinidad útil para su uso en la purificación de proteínas usando cromatografía de afinidad de lisozima económica.

En un aspecto, la invención generalmente presenta un método como se describe en la reivindicación 1. En aspectos relacionados, la invención presenta método, kits y composiciones como se definen en las reivindicaciones 2 a 34.

Se describen en el presente documento polipéptidos de lisozima mutante sustancialmente puros que contienen al menos una mutación de un aminoácido que reduce la unión entre el polipéptido de lisozima mutante y un polipéptido de tipo Tp17 (por ejemplo, reduce la unión en 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85% o 95% en relación con la unión natural) , en el que el polipéptido de lisozima mutante conserva al menos el 50%, 60%, 75%, 85% o 95% de la actividad antimicrobiana de un polipéptido de lisozima natural correspondiente. La mutación puede reducir la unión entre el polipéptido de lisozima mutante y un polipéptido de tipo Tp17 en al menos 5% en relación con la unión del polipéptido de lisozima natural, o la mutación afecta a una carga de superficie en el polipéptido natural correspondiente. La mutación puede ser en un resto de aminoácido cargado positivamente, en un resto de aminoácido cargado negativamente, o en un resto de aminoácido hidrófobo de un polipéptido de lisozima natural que entra en contacto con un polipéptido de tipo Tp17. La mutación puede ser de al menos uno, dos, tres, cuatro o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en Lys19, Arg23, Lys51, Gly55, Asn57, Arg131, Asn132 y Arg133 de lisozima humana o puede estar presente en una posición correspondiente en una lisozima derivada de otra especie (por ejemplo, procariota, eucariota, mamífero) .

También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico sustancialmente puras que codifican los polipéptidos de lisozima anteriormente mencionados, un vector que contiene dicha molécula de ácido nucleico, y una célula huésped que contiene este vector.

Como se describe en el presente documento, el polipéptido de lisozima puede ponerse en contacto con el polipéptido de tipo Tp17 antes de, durante, o después de entrar en contacto con la muestra biológica. En diversas realizaciones, el ensayo es un inmunoensayo (por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima ELISA) , transferencia de Western, ensayo de inmunoaglutinación, radioinmunoensayo, ensayo turbidimétrico, ensayo nefelométrico, ensayo inmunocromatográfico, ensayo quimioluminiscente y ensayo fluorescente) . En otras realizaciones, la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, lágrimas, saliva, esputo, líquido nasal, líquido ótico, líquido genital, líquido mamario, leche, calostro, líquido placentario, sudoración, líquido sinovial, líquido ascítico, líquido gastrointestinal, exudado, trasudado, líquido pleural, líquido pericárdico, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, bilis, fluido gástrico, semen, materia fecal, líquido de las vías respiratorias superiores, líquido peritoneal, líquido recogido de un sitio de inflamación, líquido recogido de un sitio de recogida agrupado, lavado bronquial, orina, material de biopsia, humor acuoso, material del rumen de un animal rumiante, muestra de células nucleadas, cualquier líquido asociado con una superficie mucosa, pelo y piel. En una realización preferida, el método se usa para diagnosticar sífilis.

En diversas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido de tipo Tp17 deriva de un patógeno seleccionado del grupo que consiste en una bacteria, un virus, un parásito, un plásmido, un prion, un micoplasma y un agente micótico.

En otras realizaciones de cualquiera de los aspectos previos, el patógeno es Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Yersinia pestis, Shigella fexnerii, Treponema... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar un anticuerpo anti-patógeno en un sujeto, comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con una lisozima exógena y un polipéptido de tipo Tp17, en el que el polipéptido de tipo Tp17: (i) comprende la secuencia consenso de motivo de unión a lisozima Xaan Pro His Xaan; y (ii) se une a la lisozima para formar un complejo de polipéptido de tipo Tp17-lisozima que se une a dicho anticuerpo anti-patógeno; y

(b) detectar unión de anticuerpo anti-patógeno con el complejo de polipéptido de tipo Tp17-lisozima.

2. El método de la reivindicación 1 en el que el motivo se selecciona de las siguientes secuencias CCPHAG, VCPHAG, VAPHDC, KAPHDK, VKPHDG, KKPHAK, KAPHEK, KKPHAC, VAPHAG, VKPHAK, VKPHAC, VAPHEG, VKPHEK, VCPHEK, CKPHAG, ACPHAG, KCPHDC, VKPHDK, KKPHAG y CAPHEK.

3. El método de la reivindicación 1 en el que el polipéptido de tipo Tp17 comprende la secuencia consenso CS3: Xaa Cys Pro His Ala Gly, en la que Xaa es Cys o Val.

4. Un método para potenciar la sensibilidad de un ensayo de diagnóstico para detectar en una muestra biológica una respuesta inmune contra un patógeno, comprendiendo el método añadir un polipéptido de lisozima exógena al ensayo de diagnóstico por lo que el polipéptido de lisozima se pone en contacto con un polipéptido de tipo Tp17 antes de, durante, o después de poner en contacto la muestra biológica con el polipéptido de tipo Tp17, en el que el polipéptido de tipo Tp17 se une a un polipéptido de lisozima y comprende la secuencia consenso del motivo de unión a lisozima Xaan Pro His Xaan y la adición del polipéptido de lisozima aumenta la sensibilidad del ensayo en al menos el 5%.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ensayo de diagnóstico es un ensayo de aglutinación.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el polipéptido de tipo Tp17 o el polipéptido de lisozima está fusionado con un marcador de afinidad.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el polipéptido de tipo Tp17 o el polipéptido de lisozima está fijado a un soporte sólido.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el ensayo comprende un inmunoensayo.

9. El método de la reivindicación 8 en el que el inmunoensayo se selecciona del grupo que consiste en ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) , transferencia de western, ensayo de inmunoaglutinación, radioinmunoensayo, ensayo turbidimétrico, ensayo nefelométrico, ensayo inmunocromatográfico, ensayo quimioluminiscente y ensayo fluorescente.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el polipéptido de lisozima se pone en contacto con el polipéptido de tipo Tp17 antes de, durante o después de poner en contacto la muestra biológica.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el polipéptido o los polipéptidos de tipo Tp17 son recombinantes.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el polipéptido de lisozima es recombinante.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el polipéptido de lisozima deriva de ser humano.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el patógeno se selecciona del grupo que consiste en una bacteria, un virus, un parásito, un plásmido, un prion, un micoplasma y un agente micótico.

15. El método de la reivindicación 14, en el que el patógeno es Treponema pallidum.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, lágrimas, saliva, esputo, líquido nasal, líquido ótico, líquido genital, líquido mamario, leche, calostro, líquido placentario, sudoración, líquido sinovial, líquido ascítico,

líquido gastrointestinal, exudado, trasudado, líquido pleural, líquido pericárdico, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, bilis, fluido gástrico, semen, materia fecal, líquido de las vías respiratorias superiores, líquido peritoneal, líquido recogido de un sitio de inflamación, líquido recogido de un sitio de recogida agrupado, lavado bronquial, orina, material de biopsia, humor acuoso, material del rumen de un animal rumiante, muestra de células nucleadas, cualquier fluido asociado con una superficie mucosa, pelo y piel.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes usándose el método para diagnosticar sífilis.

18. Un kit adecuado para su uso en el método de la reivindicación 1 o reivindicación 4, comprendiendo dicho kit un polipéptido de tipo Tp17 y un polipéptido de lisozima sustancialmente pura exógena, en el que el polipéptido de tipo Tp17 se une al polipéptido de lisozima y comprende la secuencia consenso del motivo de unión a lisozima Xaan Pro His Xaan.

19. El kit de la reivindicación 19, en el que el polipéptido de tipo Tp17 o el polipéptido de lisozima está unido a un soporte sólido.

20. El kit de la reivindicación 19, en el que el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en una resina, un gel, una perla, un pocillo, una columna, una microplaca, una membrana, una matriz, una placa y un dispositivo de filtro.

21. Una composición adecuada para uso en el método de la reivindicación 1 o reivindicación 4 que comprende un polipéptido de tipo Tp17 sustancialmente puro y un polipéptido de lisozima exógena sustancialmente puro, en la que el polipéptido de tipo Tp17 es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 siempre que el motivo no sea CKPHDC.

22. La composición de la reivindicación 21, en la que el polipéptido de lisozima y el polipéptido de tipo Tp17 están presentes en una relación molecular de entre aproximadamente 0, 001 y aproximadamente 1.000.000.

23. La composición de la reivindicación 21, que comprende además partículas vehículo.

24. La composición de la reivindicación 21 en la que las partículas vehículo se seleccionan del grupo que consiste en glóbulos rojos, partículas agregadas polipeptídicas, partículas poliméricas, partículas inorgánicas, partículas paramagnéticas y células de levadura.

25. La composición de la reivindicación 21, en la que el polipéptido de tipo Tp17 deriva de un patógeno seleccionado del grupo que consistente en una bacteria, un virus, un parásito, un plásmido, un prion, un micoplasma y un agente micótico.

26. La composición de la reivindicación 21, en la que el polipéptido de tipo Tp17 deriva de Treponema pallidum.

27. La composición de la reivindicación 21, en la que el polipéptido de tipo Tp17 se aísla de una muestra biológica.

28. La composición de la reivindicación 21, en la que el polipéptido de tipo Tp17 es un polipéptido recombinante.

29. La composición de la reivindicación 21, en la que el polipéptido de tipo Tp17 está fusionado con un marcador de afinidad.

30. La composición de la reivindicación 21, en la que el polipéptido de tipo Tp17 está marcado de forma detectable.

31. La composición de la reivindicación 21, en la que el polipéptido de tipo Tp17 y/o el polipéptido de lisozima está fijado a un soporte sólido.

32. El kit de la reivindicación 18, 19 o 20 o la composición de la reivindicación 21, en el que el polipéptido de lisozima comprende una secuencia derivada de un polipéptido de lisozima humana.

33. El método de la reivindicación 1, kit de la reivindicación 18 o composición de la reivindicación 21 en el que el polipéptido de tipo Tp17 es un polipéptido de tipo Tp17 maduro.

Placa de ELISA Placa de ELISA + lisozima

Suero de control

convencional humana

Control negativo 79 121

Control Positivo 2009 21717

Suero negativo para sífilis

Código de suero Placa de ELISA convencional Placa de ELISA + lisozima humana

BB01 70 81

BB02 51 60

BB03 80 133

BB04 86 66

Suero positivo para sífilis

Código de suero Placa de ELISA convencional Placa de ELISA + lisozima humana

BQ 110 113 1319

BQ 82 1381 1684

SC 57 1/10 737 1000

SC77 1453 1801

FIG. 21A

ELISA de sífilis de segunda generación

Tampón diluido de muestra Tampón diluido de muestra + HuLys Tampón diluido de muestra + HuLys

Tampón diluido de conjugado Tampón diluido de conjugado Tampón diluido de conjungado + HuLys

Código de suero Absorbancia a 450 nm Absorbancia a 450 nm Absorbancia a 450 nm

Control negativo 11 11 15

Control positivo 1377 1271 1705

Suero negativo para Syf.

BB01 5 1 7

BB02 3 0 7

BB03 5 2 57

BB04 7 4 7

Suero positivo para Syf.

BQ 110 544 460 1717

BQ 82 1408 1407 2843

SC 57 1/10 685 648 1415

SC77 1955 1838 2070

FIG. 21B

ELISA de sífilis de tercera generación

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha tenido mucho cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la EPO declina responsabilidades por este asunto.

Documentos de patentes citadas en la descripción