Composición farmacéutica para terapia de reemplazo enzimático.

Una proteína que se selecciona de (a) y (b) a continuación:

(a) una proteína que tiene actividad α

-galactosidasa, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6 donde el aminoácido 202 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6 se sustituye por ácido glutámico o ácido aspártico mientras que el aminoácido 205 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6 se sustituye por leucina, valina o isoleucina; y

(b) una proteína que tiene actividad α-galactosidasa y que comprende una secuencia de aminoácidos donde de uno a diez aminoácidos distintos de los aminoácidos sustituidos 202 y 205 se suprimen, sustituyen o añaden en la secuencia de aminoácidos en (a) y donde los aminoácidos 42 a 45, 59, 91 a 95, 131 a 141, 164 a 172, 206, 223 a 234, 256 a 268 y 364 en la secuencia de aminoácidos en (a) no están mutados.

Composición farmacéutica para terapia de reemplazo enzimático Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva enzima altamente funcional con una especificidad de sustrato alterada, específicamente una proteína recombinante que tiene actividad a-galactosidasa. La enzima puede usarse en una composición farmacéutica para terapia de reemplazo enzimático, específicamente para tratar enfermedad de Fabry.

Antecedentes de la técnica

Para la deficiencia enzimática hereditaria, para la que no se conocen hasta la fecha tratamientos radicales, se ha desarrollado gradualmente terapia de reemplazo enzimático en la que se produce una enzima por ingeniería genética y después se administra al vaso sanguíneo por goteo intravenoso o similar. Como ejemplo, la deficiencia enzimática hereditaria, cuya frecuencia es relativamente alta y que se designa como una enfermedad especifica (enfermedad intratable), la enfermedad de Fabry (deficiencia de a-galactosidasa hereditaria, también denominada enfermedad lisosómica, que es una de las enfermedades genéticas) es muy conocida (véase Kenneth J. Dean et al., Fabry Disease, "Practical Enzymology of the Sphingolipidoses", U.S.A., Aln R. Liss, Inc., 1997, p. 173-216).

La enfermedad de Fabry es un trastorno metabólico de glucolípidos que se desarrolla de la siguiente manera: como resultado de una disminución de la actividad o deficiencia de una enzima denominada "a-galactosidasa", presente en el lisosoma, uno de los orgánulos intracelulares humanos, un glucolípido denominado globotriaosilceramida (GL-3; también denominado trihexósido de ceramida (THC)), que es un sustrato in vivo de la enzima, no se degrada y por lo tanto se acumula en el organismo (por ejemplo, en los vasos sanguíneos, piel, córnea, nervios, riñones y en el corazón).

Dado que un gen que codifica la a-galactosidasa se encuentra en el cromosoma X, esta enfermedad tiene una herencia asociada al cromosoma X. Por lo tanto, en esta enfermedad, se presenta una característica clínica definida principalmente en hombres hemicigotos. Se cree que la "enfermedad de Fabry clásica", que sigue una evolución clínica típica, se desarrolla en aproximadamente uno de cada 40.000 niños. Síntomas tales como dolor en la mano y en el pie, hlpohldrosls, angloqueratoma y opacidad de la córnea, aparecen durante la infancia y la adolescencia; estos síntomas progresan y después provocan daño orgánico sistémico tal como insuficiencia renal, insuficiencia cardiaca y trastorno cerebrovascular en la edad adulta o posteriormente, lo que se convierte en una causa de muerte. También existe la "enfermedad de Fabry variante", que no sigue dicha evolución clínica típica, tal como la "enfermedad de Fabry clásica" y que se desarrolla tarde y sigue una evolución relativamente moderada. En pacientes con este tipo de enfermedad, se observa una actividad a-galactosidasa remanente, aunque es baja. Como una enfermedad de Fabry variante, por ejemplo, se conoce la "enfermedad de Fabry cardiaca", que provoca la acumulación de glucolípidos anteriormente mencionada principalmente en el corazón. En consecuencia, se produce hipertrofia cardiaca, y se provocan trastornos tales como insuficiencia cardiaca y arritmia. Por otro lado, en mujeres pacientes heterocigotas con enfermedad de Fabry, se observan diversos tipos de características clínicas de acuerdo con las características del cromosoma X. Específicamente, los casos varían de casos graves, que son similares a los de hombres hemicigotos, a casos en los que no se observan sustancialmente ningún síntoma. Sin embargo, de acuerdo con investigaciones recientes, se ha puesto de manifiesto que la mayoría de las mujeres pacientes heterocigotas con enfermedad de Fabry desarrollan algún tipo de síntoma con la edad. Existe el punto de vista de que estas mujeres no deberían considerarse "portadoras" sino "pacientes".

Recientemente, también se ha establecido la terapia de reemplazo enzimático para enfermedad de Fabry, y se ha usado ampliamente una a-galactosidasa humana recombinante producida en una célula derivada de mamíferos como un elemento activo de un agente terapéutico de enfermedad de Fabry en la terapia anterior (véase Eng CM et al., Am J Hum Genet, 68: 711-722 (2001); Eng CM et al., N Engl J Med, 345: 9-16 (2001); y Schiffmann R et al., Proc Nati Acad Sci USA, 97: 365-370 (2000)).

También se ha propuesto un método en el que puede usarse una a-galactosidasa humana recombinante producida con una célula no animal (por ejemplo, de levadura) como un hospedador para el tratamiento de la enfermedad de Fabry (terapia de reemplazo enzimático) (véase la Publicación de Solicitud de Patente No Examinada Japonesa n° 2002-369692), un método terapéutico génlco en el que una enzima se reemplaza introduciendo un gen que codifica la a-galactosidasa humana en una célula de un tejido afectado para expresar el gen (véase Publicación de Solicitud de Patente No Examinada Japonesa (Traducción de la Solicitud de PCT) N° 2002-522509), y similares.

Divulgación de la invención

Sin embargo, dado que con frecuencia se administra un agente enzimático existente, usado para el reemplazo enzimático para el tratamiento de enfermedad de Fabry, a pacientes que no tienen la enzima (a-galactosidasa humana) desde el principio, la enzima contenida en el agente terapéutico se reconoce como una sustancia extraña

en muchos pacientes a los que se administra el agente enzimático, y se produce un anticuerpo, dando como resultado un problema de efectos secundarios adversos a una alta frecuencia, principalmente, reacciones alérgicas. Dicho problema se produce de forma similar en el caso en el que la enzima se reemplace usando un procedimiento terapéutico génico.

Además, dicho agente enzimático usado para el reemplazo enzimático se administra en los vasos sanguíneos, pero la a-galactosidasa es en sí misma inestable en la sangre. En consecuencia, en la terapia actual, el agente enzimático debe administrarse frecuentemente (una vez cada dos semanas), y puede ser necesario aumentar la dosificación por cada administración. Además, la a-galactosidasa humana (a-GAL) tiene un número relativamente pequeño de cadenas de azúcares (cadenas de azúcares de tipo N) con los que puede unirse un resto de manosa-6- fosfato (M6P) para la captación por una célula (más específicamente, por un lisosoma en una célula) de un órgano afectado. Por lo tanto, la captación de a-GAL por una célula a través de la sangre es difícil. En particular, las eficacias de captación en el riñón o corazón, órganos afectados predominantemente por la enfermedad de Fabry, son bajas, y por lo tanto el efecto terapéutico para nefropatía o cardiopatía apenas es suficiente. Por consiguiente, para permitir que una célula diana capte una determinada cantidad de enzima después de la terapia, se requiere una gran cantidad de enzima. En consecuencia, para el reemplazo enzimático, es necesario administrar un agente enzimático más frecuentemente y en mayor cantidad. Dicha terapia supone una gran carga física, mental y económica para los pacientes y, por lo tanto, afecta de forma adversa a la "calidad de vida (CDV)".

Por consiguiente, es un objeto de la presente Invención proporcionar una composición farmacéutica para tratar la enfermedad de Fabry, que usa una proteína que tiene actividad a-GAL, que no muestra efectos secundarios alérgicos, que es altamente estable en sangre (en plasma) y que puede captar fácilmente una célula de un órgano afectado. También es un objeto de la presente Invención proporcionar una nueva enzima altamente funcional con una especificidad de sustrato alterada, como la proteína anteriormente mencionada que tiene actividad a-GAL.

Los presentes inventores realizaron estudios intensivos para resolver los problemas anteriores. Como resultado, los presentes Inventores se centraron en una "a-N-acetilgalactosamlnldasa (a-NAGA)", una proteína que tiene una especificidad de sustrato diferente de la de a-GAL pero que tiene una estructura general muy similar a la de a-GAL. Los presentes Inventores han pensado que el problema anterior puede resolverse si se usa una nueva enzima altamente funcional (un muíante de a-NAGA), obtenida alterando la especificidad de sustrato de a-NAGA mediante la alteración de la estructura del sitio activo de a-NAGA para adquirir actividad a-GAL, como un elemento activo de una composición farmacéutica para tratar la enfermedad de Fabry que puede usarse para terapia de reemplazo enzimático.

Sin embargo, en la técnica, se conocen generalmente los siguientes hechos.

1) Cuando una parte de los aminoácidos de una proteína se sustituye por un aminoácido diferente, es posible que se altere el estado de la acción mutua (enlace... [Seguir leyendo]

1. Una proteína que se selecciona de (a) y (b) a continuación:

(a) una proteína que tiene actividad a-galactosidasa, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 6 donde el aminoácido 202 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 6 se sustituye por ácido glutámico o ácido aspártico mientras que el aminoácido 205 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 6 se sustituye por leucina, valina o isoleucina; y

(b) una proteína que tiene actividad a-galactosidasa y que comprende una secuencia de aminoácidos donde de uno a diez aminoácidos distintos de los aminoácidos sustituidos 202 y 205 se suprimen, sustituyen o añaden en la secuencia de aminoácidos en (a) y donde los aminoácidos 42 a 45, 59, 91 a 95, 131 a 141, 164 a 172, 206, 223 a 234, 256 a 268 y 364 en la secuencia de aminoácidos en (a) no están mutados.

2. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el aminoácido sustituido 202 de la proteína de la reivindicación 1 (a) es ácido glutámico mientras que el aminoácido sustituido 205 de la proteína de (a) anterior es leucina.

3. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 para uso en un método para tratar la enfermedad de Fabry.

4. Un gen que se selecciona de (a) y (b) a continuación:

(a) un gen que codifica la proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

(b) un gen que codifica una proteína que tiene actividad a-galactosidasa y que comprende ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID N°: 5 donde los nucleótidos 604-606 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N°: 5 se sustituyen por nucleótidos de un codón de ácido glutámico o ácido aspártico, donde los nucleótidos 613-615 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N°: 5 se sustituyen por nucleótidos de un codón de leucina, valina o isoleucina y donde los nucleótidos 124 a 135, 175 a 177, 271 a 285, 391 a 423, 490 a 516, 616 a 618, 667 a 702, 766 a 804 y 1.090 a 1.092 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N°: 5 no están mutados.

5. Un gen de acuerdo con la reivindicación 4, donde los nucleótidos sustituidos 604-606 del gen de la reivindicación 4 (b) anterior son nucleótidos de un codón de ácido glutámico mientras que los nucleótidos sustituidos 613-615 del gen de la reivindicación 4 (b) son nucleótidos de un codón de leucina.

6. Un vector recombinante que comprende el gen de acuerdo con la reivindicación 4 o 5.

7. Un transformante que comprende un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Un método para producir una proteína, que comprende las etapas de: cultivar el transformante de acuerdo con la reivindicación 7; y recoger una protelna que tiene actividad a-galactosidasa del producto cultivado resultante.