Complejos lipídicos recubiertos con PEG y su uso.

Una composición de lípidos que comprende

al menos un primer componente lipídico,

al menos un primer lípido auxiliar, y

un compuesto protector que es extraíble de la composición de lípidos en condiciones in vivo, por lo cual el primer componente lipídico es un compuesto de acuerdo con la fórmula (I),**Fórmula**

en donde R1 y R2 son cada uno y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo y alquenilo que contiene de 8 a 30 átomos de carbono;

n es cualquier número entero entre 1 y 4;

R3 es un grupo acilo seleccionado entre el grupo que consiste en lisil, ornitilo, 2,4-diaminobutirilo, histidilo y una fracción acilo de acuerdo con la fórmula (II),**Fórmula**

en donde m es cualquier número entero de 1 a 3, en donde el NH3

+ es opcionalmente ausente, y

Y- es un anión farmacéuticamente aceptable,

en donde el compuesto protector se selecciona del grupo que consiste en PEG, HEG, almidón polihidroxietilo (polyHES) y un polipropileno y en donde el compuesto protector está unido a una ceramida, en donde la ceramida comprende, como el sustituyente, una cadena de carbono corta de 6 a 10 átomos de carbono y en donde la ceramida se une covalentemente al compuesto protector.

Complejos lipidióos recubiertos con PEG y su uso.

La presente invención está relacionada con lípidos catiónicos, composiciones que contienen los mismos y el uso de los mismos, así como un método para transferir los compuestos químicos a las células.

Tanto la biología molecular, así como la medicina molecular en gran medida dependen de la Introducción de compuestos biológicamente activos en las células. Tales compuestos biológicamente activos comprenden por lo general, entre otros, ADN, ARN, así como péptidos y proteínas, respectivamente. La barrera que hay que superar es por lo general una blcapa llpídlca que tiene una superficie exterior cargada negativamente. En la técnica, se ha desarrollado una serle de tecnologías para penetrar la membrana celular y para introducir por lo tanto los compuestos biológicamente activos. Algunos métodos concebidos para uso en laboratorio, sin embargo, no se pueden utilizar en el campo médico y más particularmente no son apropiados para la administración de fármacos. Por ejemplo, los métodos de electroporaclón y balísticos conocidos en la técnica, que, en todo caso, sólo permiten una administración local de compuestos biológicamente activos. Aparte de dichas membranas celulares de bicapa lipídica comprenden también sistemas de transporte. De acuerdo con lo anterior, se realizaron esfuerzos para utilizar este tipo de sistemas de transporte con el fin de transferir los compuestos biológicamente activos a través de la membrana celular. Sin embargo, debido a la especificidad o la reactividad cruzada de tales sistemas de transporte, su uso no es un método de aplicación general.

Un enfoque de aplicación más general descrito en la técnica para la transferencia de compuestos biológicamente activos en las células, es el uso de vectores virales. Sin embargo, los vectores virales pueden ser utilizados sólo para la transferencia de genes eficientemente en algunos tipos de células; pero no pueden ser utilizados para introducir moléculas de síntesis química en las células.

Un enfoque alternativo fue el uso de los llamados liposomas (Bangham, J. Mol. Biol. 13, 238-252). Los liposomas son vesículas que se generan en asociación de lípidos anfifílicos en agua. Los liposomas comprenden por lo general bicapas de fosfolípidos dispuestas concéntricamente. Dependiendo del número de capas los mismos liposomas se pueden clasificar como pequeñas vesículas unllamelares, vesículas multilamelares y grandes vesículas multilamelares. Se ha demostrado que los liposomas son eficaces agentes de suministro, ya que permiten incorporar compuestos hidrófilos en las capas intermedias acuosas, mientras que los compuestos hidrófobos se incorporan en las capas de lípidos. Es bien conocido en la técnica que tanto la composición de la formulación de lípidos, así como su método de preparación tienen un efecto sobre la estructura y el tamaño de los agregados de lípidos resultantes y por lo tanto en los liposomas. También se sabe que los liposomas incorporan los lípidos catiónicos.

Los lípidos catiónicos, aparte de ser componentes de liposomas, también han atraído una considerable atención, ya que pueden ser utilizados como tales para la administración celular de biopolímeros. Utilizando lípidos catiónicos, cualquier compuesto aniónico se puede encapsular esencialmente de una manera cuantitativa debido a la interacción electrostática. Además, se cree que los lípidos catiónicos interactúan con las membranas celulares cargadas negativamente que inician el transporte de la membrana celular. Se ha encontrado que el uso de una formulación liposómica puesto que contiene lípidos catiónicos o el uso de lípidos catiónicos como tales junto con un compuesto biológicamente activo requiere un enfoque heurístico puesto que formulación es de uso limitado, ya que normalmente puede administraciónr plásmidos en algunos pero no todos los tipos de células, por lo general en ausencia de suero.

Las relaciones de carga y/o masa de los lípidos y los compuestos biológicamente activos para ser transportados por ellos han resultado ser un factor crucial en la administración de diferentes tipos de dichos compuestos biológicamente activos. Por ejemplo, se ha demostrado que las formulaciones lipídicas apropiadas para la administración de plásmidos que comprenden 5,000 a 10,000 bases de tamaño, por lo general no son eficaces para la administración de oligonucleótidos tales como ribozimas sintéticas o moléculas antisentido que comprenden por lo general aproximadamente 10 a aproximadamente 50 bases. Además, recientemente se ha indicado que las condiciones de administración óptimas para oligonucleótidos antisentido y ribozimas son diferentes, incluso en el mismo tipo de célula.

La Patente de los Estados Unidos 6,395,713 revela composiciones basadas en lípidos catiónicos que por lo general consisten en un grupo lipófilo, un enlazante y un grupo de cabeza y el uso de tales composiciones para la transferencia de compuestos biológicamente activos en una célula.

La Solicitud de Patente Internacional WO 99/04819 revela una composición liposómica para la administración de un catalizador de ácido nucleico, en donde la composición comprende un conjugado polietileno (PEG)-ceramida, un lípido y un catalizador de ácido nucleico.

La Solicitud de Patente Internacional WO 96/10392 revela un liposoma fusogénico que comprende un lípido capaz de adoptar una fase no laminar, si bien, capaz de asumir una estructura bicapa en presencia de una componente de

estabilización bicapa; y un componente de estabilización bicapa reversiblemente asociado con el lípido para estabilizar el lípido en una estructura de bicapa.

La Solicitud de Patente Internacional WO 01/05374 revela partículas de un agente terapéutico encapsulado-lípido totalmente de un agente terapéutico cargado, en donde las partículas se preparan mediante la combinación de una composición de lípidos que contiene las vesículas de lípido preformadas, un agente terapéutico cargado, y un agente desestabilizante para formar una mezcla de vesículas preformadas y agente terapéutico en un solvente de desestabilización.

La Solicitud de Patente Internacional WO 02/34236, revela los vehículos de administración sistémica a base de lípidos y el método para dirigir selectivamente un agente activo a un tejido específico.

La Patente de los Estados Unidos 6,586,410 se relaciona con un método para introducir un ácido nucleico en una célula, en donde el método comprende poner en contacto dicha célula con una partícula de lípido-ácido nucleico que comprende un lípido catiónico, un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas, y un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico en las partículas de lípido-ácido nucleico es resistente en solución acuosa a la degradación con una nucleasa.

La Solicitud de Patente Internacional WO 01/80900 revela los métodos para la administración de ácidos nucleicos a las células, en donde los métodos se basan en el hallazgo de que la presencia de desestabilizadores de membrana endosomal tales como el calcio conduce a un aumento en la eficiencia de la transfección de plásmidos formulados como partículas estabilizadas plásmido-lípido.

La Solicitud de Patente Internacional WO 2005/105152 revela un lípido catiónico y composiciones que contienen el lípido para la administración de ácidos nucleicos.

El problema subyacente a la presente invención era proporcionar un medio para introducir compuestos biológicamente activos en las células, preferiblemente células animales. Un problema adicional subyacente a la presente invención es proveer un agente de administración de ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos pequeños tales como ARNsi, siNA y ARNi o aptámeros y espiegélmeros.

Incluso otro problema subyacente de la presente invención es proveer un agente de administración que tiene buenas características de transfección y de administración mientras que proporciona un tiempo de circulación in vivo más largo.

Estos problemas se resuelven por el contenido de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las realizaciones preferidas se pueden tomar de las reivindicaciones adjuntas dependientes de la misma.

El problema subyacente de la presente invención también se resuelve en un primer aspecto mediante una composición de lípidos que comprende

al menos un primer componente lipídico,

al menos un primer lípido auxiliar, y

un compuesto protector que es extraíble de la composición de lípidos en condiciones in vivo, por lo cual el primer componente lipídico es un compuesto de acuerdo con la fórmula (I),

(I)

1. Una composición de lípidos que comprende al menos un primer componente lipídico, al menos un primer lípido auxiliar, y

un compuesto protector que es extraíble de la composición de lípidos en condiciones in vivo, por lo cual el primer componente lipídico es un compuesto de acuerdo con la fórmula (I),

(1)

en donde Ri y R2 son cada uno y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo y alquenilo que contiene de 8 a 30 átomos de carbono;

n es cualquier número entero entre 1 y 4;

R3 es un grupo acilo seleccionado entre el grupo que consiste en lisil, ornitilo, 2,4-diaminobutirilo, histidilo y una fracción acilo de acuerdo con la fórmula (II),

O

NHj+ NH+

Y` ' (ID

en donde m es cualquier número entero de 1 a 3, en donde el NH3+ es opcionalmente ausente, y Y- es un anión farmacéuticamente aceptable,

en donde el compuesto protector se selecciona del grupo que consiste en PEG, HEG, almidón polihidroxietilo (polyHES) y un polipropileno y en donde el compuesto protector está unido a una ceramida, en donde la ceramida comprende, como el sustituyente, una cadena de carbono corta de 6 a 10 átomos de carbono y en donde la ceramida se une covalentemente al compuesto protector.

2. La composición de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cadena de carbono corta es una cadena de hidrocarburo, preferiblemente una cadena de hidrocarburo de 8 átomos de carbono.

3. La composición de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el compuesto protector es PEG2000 o PEG5000.

4. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición comprende un constituyente adicional y/o un segundo lípido auxiliar.

5. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composición de lípidos comprende un ácido nucleico, por lo cual dicho ácido nucleico es preferiblemente el constituyente adicional.

6. La composición de lípidos de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de ARNi, ARNsi, siNA, ácido nucleico antisentido, ribozimas, aptámeros y espiegélmeros.

7. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el compuesto protector es un conjugado de PEG y ceramida.

8. La composición de lípidos de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el sustituyente de la ceramida consiste de una cadena de carbono corta de 8 átomos de carbono.

9. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en donde la ceramida es el primer lípido auxiliar.

10. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en donde la ceramida es el segundo lípido auxiliar.

11. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el compuesto protector comprende un enlazante sensible al pH o una fracción sensible al pH.

12. La composición de lípidos de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el enlazante o fracción es un enlazante aniónico o una fracción aniónica

13. La composición de lípidos de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el enlazante aniónico o fracción amónica es menos aniónica o neutra en un ambiente ácido, por lo cual preferiblemente tal ambiente ácido es un endosoma.

14. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde el enlazante sensible al pH o la fracción sensible al pH se selecciona del grupo que consta de oligo (ácido glutámico), oligofenolato(s) y ácido dietilentriamina pentaacético.

15. La composición de lípidos de acuerdo con la reivindicación 1-14, en donde Ri y R2 son cada uno y se seleccionan independientemente del grupo que consiste de laurilo, miristilo, palmitilo y oleilo.

16. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de 1-15, en donde R1 es laurilo y R2 es miristilo; o R1 es palmitilo y R2 es oleilo.

17. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde m es 1 o 2.

18. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde el compuesto es un lípido catiónico, preferiblemente en asociación con un anión Y".

19. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde Y" se selecciona del grupo que consiste en halogenuros, acetato y trifluoroacetato.

20. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en

- ácido (5-arg¡nil-2,3-dlam¡no proplónlco -N-palmltil-N-olell-amlda trlclorhldrato

- ácido p-arginil-2,3-diamino propiónico -N-lauril-N-miristil-amida triclorhidrato

y

- s-arginil-lisina-N-lauril-N-miristil-amida triclorhidrato

21. La composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde la composición comprende un portador.

22. Una composición farmacéutica que comprende una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 y un compuesto farmacéuticamente activo y preferiblemente un portador farmacéuticamente aceptable.

23. La composición de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el compuesto farmacéuticamente activo y/o el constituyente adicional se selecciona del grupo que consiste en péptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos y ácidos nucleicos.

24. La composición de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la proteína es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

25. La composición de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN, ARN, PNA y LNA.

26. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 25, en donde el ácido nucleico es un ácido nucleico funcional, por lo cual preferiblemente el ácido nucleico funcional se selecciona del grupo que consiste en ARNI, ARNsi, siNA, ácido nucleico antisentido, ribozimas, aptámeros y espiegélmeros.

27. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en donde el primer lípido auxiliar y/o el segundo lípido auxiliar se selecciona del grupo que consiste en fosfolípldos y esteroides, preferiblemente bajo la condición de que el primer y/o el segundo lípido auxiliar sea diferente de una ceramida.

28. La composición de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el primer y/o segundo lípido auxiliar o componente lipídico auxiliar se selecciona del grupo que consiste de 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina y 1,2-dioleil-sn- glicero- 3-fosfoetanolamina.

29. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 28, en donde el contenido del componente lipídico auxiliar es de aproximadamente 20% mol a aproximadamente 80% mol del contenido total de lípidos de la composición.

30. La composición de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el contenido del componente lipídico auxiliar es de aproximadamente 35 % mol a aproximadamente 65% mol.

31. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en donde el lípido es p-arginil-2,3- diamino ácido proplónico-N-palmitil- N-oleil-amldtrlclorhldrato, y el lípido auxiliar es 1,2-difitanoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamlna.

32. La composición de acuerdo con la reivindicación 31, en donde el lípido es 50% mol y el lípido auxiliar es 50% mol del contenido total de lípidos de la composición.

33. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 32, en donde la composición comprende además un segundo lípido auxiliar.

34. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde el primer y/o el segundo lípido auxiliar comprende un grupo que se selecciona del grupo que consiste en una fracción de PEG, una fracción HEG, una fracción de almidón polihidroxietilo (polyHES) y una fracción de polipropileno, por el cual dicha fracción provee preferiblemente un peso molecular de aproximadamente 500 a 10000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 2000 a 5000 Da.

35. La composición de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el lípido auxiliar que comprende la fracción de PEG se selecciona del grupo que consiste de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina y 1,2-dialquil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina.

36. La composición de acuerdo con la reivindicación 35, en donde la fracción de PEG del lípido auxiliar tiene un peso molecular de 2,000 a 5,000 Da, preferiblemente un peso molecular de 2,000 Da.

37. La composición de acuerdo con la reivindicación 36, en donde la composición comprende como el componente lipídico p-arginil-2,3- diamino ácido propiónico -N-palmitil-N-oleil-amida triclorhidrato, como un primer lípido auxiliar 1,2- d ¡fita n o i l-s n-g I i ce ro- 3-fosfoetanolamina y como un segundo lípido auxiliar 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina- PEG2000.

38. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, en donde el contenido del segundo lípido auxiliar es de aproximadamente 0,05% mol a 4,9 % mol, preferiblemente de aproximadamente 1 a 2% mol.

39. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 38, en donde la composición contiene de aproximadamente 1 a 10% mol, más preferiblemente 1 a 7.5% mol y más preferiblemente de 1 a 5% mol del conjugado de PEG y la ceramida.

40. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 39, en donde el contenido del primer componente lipídico es de aproximadamente 42.5% mol a 50% mol, el contenido del primer lípido auxiliar es de aproximadamente 42.5% mol a 50% mol, por lo cual la suma del contenido del primer componente lipídico, del primer lípido auxiliar y del conjugado de PEG y la ceramida es 100% mol.

41. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40, en donde el ácido nucleico funcional es un ácido ribonucleico de doble hebra, en donde la composición comprende además un ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico funcional que es más preferiblemente un ácido ribonucleico de doble hebra y más preferiblemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de ARNi, ARNsi, siNA, ácido nucleico antisentido y ribozima, por lo cual preferiblemente la relación molar de ARNi con el lípido catiónico es de aproximadamente 0 a 0.075, preferiblemente de aproximadamente 0.02 a 0.05 y aún más preferiblemente 0.037.

42. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, en donde el primer componente lipídico y/o al menos uno de los lípidos auxiliares y/o el compuesto protector está/están presentes como una dispersión en un medio acuoso.

43. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, en donde el primer componente lipídico y/o al menos uno de los lípidos auxiliares y/o el compuesto protector está/están presentes como una solución en un solvente miscible en agua, por lo cual preferiblemente el solvente se selecciona del grupo que consiste de etanol y tert- butanol.

44. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, para la fabricación de un medicamento.

45. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, como un agente de transferencia.

46. Uso de acuerdo con la reivindicación 45, en donde el agente de transferencia transfiere un componente farmacéuticamente activo y/o un constituyente adicional en una célula, preferiblemente una célula de mamífero y más preferiblemente una célula humana.

47. Un método in vitro para la transferencia de un compuesto farmacéuticamente activo y/o un constituyente adicional en una célula o a través de una membrana, preferiblemente una membrana celular, que comprende las siguientes etapas:

- proporcionar la célula o la membrana;

- proporcionar una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, por lo cual la composición comprende el compuesto farmacéuticamente activo y/o el constituyente adicional; y

- poner en contacto la célula o la membrana con la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43.

48. El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el método comprende como etapa adicional:

- detectar el compuesto farmacéuticamente activo y/o el constituyente adicional en la célula y/o más allá de la membrana.

49. Un lipoplexo que comprende una composición de lípidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43; y ARNsi.