Combinaciones de polimorfismos para determinar la expresión específica de alelo de IGF2.

Método para determinar pérdida de impronta en el gen del Factor de Crecimiento Insulínico de tipo 2 (IGF2) de un individuo,

donde el método comprende

detectar el genotipo del SNP del gen IGF2 en el individuo, en donde

(a) se determina el genotipo de al menos las SEQ ID Nos: 8, 11, 14, y 16, y opcionalmente también los SNP seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 1, 5, 9, 10, 2, 3, 4, 6, 7, 12, 13 y 15, o

(b) se determina el genotipo de al menos las SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 y 16, determinando de ese modo si el individuo es heterocigoto o homocigoto en cada uno de los SNP;

cuantificando en una muestra del individuo la cantidad de ARN que comprende dos opciones polimórficas de al menos un SNP heterocigoto;

determinando una relación de la cantidad de ARN que comprende dos opciones polimórficas de al menos un SNP heterocigoto; y correlacionando la relación de ARN con la pérdida de impronta del gen IGF2.

Combinaciones de polimorfismos para determinar la expresión específica de alelo de IGF2

Antecedentes de la invención El gen paraelfactorde crecimientosimilara la insulina de tipo 2, o IGF2, se localiza en un grupo de genes impresos en el cromosoma humano 11p15.5. La impronta genómica es un importante mecanismo de regulación génica en el que una copia del gen se expresa normalmente y la otra copia se silencia mediante una marca epigenética de origen parental. Normalmente, el IGF2 está impreso en los tejidos humanos maternalmente y, por lo tanto, únicamente se expresa a partir de la copia del gen heredado por vía paterna (DeChiara TM, et al. Cell 64, 849-859 (1991) ; Rainier S, et al, Nature 362, 747-749 (1993) ; Ogawa, et al, Nature 362, 749-751 (1993) ) . La pérdida de impronta del IGF2 (denominada pérdida de impronta, o LOI por sus siglas en inglés) ha sido claramente asociada a varios tipos de cáncer (alrededor de 20 tipos de tumores revisados en Falls, et al. 1999, AJP 154, 635-647) . Además, la creciente evidencia indica que los individuos que presentan LOI del IGF2 pueden tener un riesgo elevado de desarrollar cáncer colorrectal (Kinochi et al., 1996, Cancer Letters 107, 105-108 (1996) ; Nishihara S. 2000, Int. Jour. Oncol. 17, 317-322; Cui H 1998, Nature Medicine 4-11, 1276-1280; Nakagawa H 2001, PNAS 98-2, 591-596) . La LOI del IGF2 puede detectarse en tejidos normales de pacientes con cáncer, incluyendo sangre periférica y mucosa colónica normal (Kinochi et al., 1996, Cancer Letters 107, 105-108 (1996) ; Ogawa, et al, Nature Genetics 5, 408-412 (1993) ; Cui H, Science 299, 1753 (2003) ) , yen los tejidos normales de personas que se cree que no tienen cáncer (Cui H, et al. Nature Medicine 4-11, 1276-1280 (1998) ; Cui H, Science 299, 1753 (2003) ; Woodson K et al., JNCI 96, 407-410 (2004) ; Cruz-Correa Met al., Gastroenterology 126, 964-970 (2004) ) .

Diversos estudios de sangre periférica de población general indican que entre un 7 y un 10 % de la población presenta pérdida de impronta del IGF2 en el tejido de la mucosa colónica. Tres estudios retrospectivos indican que las probabilidades de que los pacientes con cáncer colorrectal presenten LOI del IGF2 ya sea en sangre periférica o en la mucosa colónica son significativamente mayores (entre 2-21 veces) que las probabilidades de que un grupo de controldelamismaedadsincáncerpresente LOI.Estosestudiossugierenque la LOIdel IGF2 puede predisponer a individuos por lo demás sanos a tener un cáncer colorrectal. Por lo tanto, un ensayo de riesgo basado en la detección de la LOI del IGF2 puede tener un beneficio clínico en un futuro (Cui H, et al. Nature Medicine 4-11, 12761280 (1998) ; Cui H, Science 14, 1753-1755 (2003) ; Woodson K 2004, JNCI 96, 407-410; Cruz-Correa M, Gastroenterology 126, 964-970 (2004) ) . Estos estudios muestran que las personas con LOI del IGF2 (también denominada biomarcador del IGF2) , pueden tener hasta 20 veces más probabilidad de desarrollar cáncer colorrectal que los individuos sin el biomarcador de IGF2.

La detección de LOI del IGF2 se basa en un ensayo cuantitativo de expresión génica específica de alelo, en el que se cuantifican los transcritos procedentes de cada una de ambas copias del gen IGF2. A continuación se comparan las cantidades entre sí para determinar una relación de la expresión genética alélica, que se compara posteriormente con un valor umbral. Si la concentración del alelo menos abundante es “relativamente similar” a la concentración del alelo más abundante, entonces se determina que la impronta del IGF2 se ha perdido. Si la concentración del alelo menos abundante es “relativamente diferente” a la concentración del alelo más abundante, entonces se determina que la impronta del IGF2 está presente. Un método para medir el estado de la impronta del IGF2 en una muestra es determinar en primer lugar el genotipo o genotipos de uno o más sitios polimórficos en la región transcrita del gen IGF2. Los marcadores heterocigotos en la región transcrita del gen proporcionan marcas moleculares convenientes mediante los cuales pueden distinguirse entre sí los alelos individuales del gen IGF2 en una muestra. La transcripción de ARN a partir de cada una de las dos copias del gen IGF2 puede medirse independientemente con ensayos cuantitativos específicos de alelos. Por lo tanto, puede realizarse una comparación de la cantidad de expresión de un alelo con la cantidad de expresión del otro alelo, y puede determinarse el estado de la impronta del gen IGF2 (véase Figura 2) .

El IGF2 tiene cuatro promotores, donde cada uno dirige la expresión de transcritos con corte y empalme alternativo, de manera específica al tejido (Figura 1A) . Los exones 7, 8 y 9 están presentes en todos los transcritos, mientras que se ha indicado que los exones 1-6 se expresan de una manera específica al promotor. El exón 9 incluye una extensión corta de la secuencia de codificación de proteínas seguida de una región 3’ UTR considerablemente más larga. Los marcadores polimórficos en los exones 7, 8 y 9 son por lo tanto útiles en la determinación del estado de la impronta del IGF2 al permitir la detección de la expresión específica de alelos de la transcripción del IGF2 dirigida a partir de cualquiera de los cuatro promotores del IGF2.

Son conocidos para los expertos en el arte, cuatro ensayos de expresión específica de alelo que miden el estado de la impronta del IGF2. En Woodson, et al. se midió el estado de la impronta del IGF2 con una combinación de dos ensayos basados en SNP (rs680 y rs2230949) (Woodson K 2004, JNCI 96, 407-410) . Ambos SNP se encuentran en el exón 9 del IGF2, pero en Woodson et al. se describe que se encuentran en desequilibrio de ligamiento mínimo. Por lo tanto, los intentos para medir la LOI de un individuo con dicha combinación de marcadores aumenta la probabilidad de que el individuo sea heterocigoto para al menos uno de los dos SNP, y por lo tanto aumenta la probabilidad de que pueda determinarse el estado de la LOI del individuo. Los autores demostraron que el primer SNP, el segundo SNP o ambos SNP eran informativos (es decir, eran heterocigotos y, por lo tanto, permitían la medición de la LOI del IGF2) en 48 de 106 pacientes evaluados (o un 45%) . En Cui et al. se midió la impronta del IGF2 con una combinación de dos ensayos, uno que establecía como diana un SNP (rs680) y un segundo que medía polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción de una repetición de secuencias simples dentro del exón 9 del IGF2. Los autores demostraron que el SNP, la repetición, o ambos marcadores eran informativos en 191 de 421 (o en un 45 %) pacientes evaluados (Cui H, et al. Nature Medicine 4-11, 1276-1280 (1998) ) .

Estudios previos han demostrado que el uso de estos polimorfismos da como resultado una baja frecuencia combinada de heterocigosidad en poblaciones de pacientes y, por lo tanto, un gran número de individuos en estas poblaciones eran “no informativos”, de tal manera que no pudo determinarse el estado de la impronta de su IGF2. La presente solicitud describe un SNP de reciente descubrimiento en el exón 9 del IGF2, y el descubrimiento de combinaciones útiles de los SNP que permiten mediciones de la LOI exitosas en una mayor proporción de la población humana. La capacidad para medir la LOI utilizando estos polimorfismos en la población en general tendrá un profundo beneficio médico, actuando como la base de diversos ensayos moleculares de diagnóstico y terapéuticos.

La informatividad de un SNP dado para la detección de LOI se basa en la frecuencia de heterocigosidad del SNP dentro de una población. Además, la informatividad óptima de una combinación de diferentes SNP depende del ligamiento entre los diferentes marcadores. Por ejemplo, si dos SNP quedan dentro de un bloque de haplotipo común, el uso combinado de los dos SNP proporciona un aumento mínimo de la informatividad en relación con el uso de cualquiera de los dos SNP por sí solo. Sin embargo, si dos SNP no están en el mismo bloque de haplotipo (es decir, están en un desequilibrio de ligamiento mínimo) , el uso combinado de los dos SNP proporciona un aumento efectivo de la informatividad en relación con el uso de cualquiera de los dos SNP por sísolo.

Breve resumen de la invención La presente invención proporciona métodos para la determinación de la pérdida de impronta en el gen del Factor de Crecimiento insulínico de tipo 2 (IGF2) de un individuo. El método comprende,

detectar el genotipo del SNP del gen IGF2 en el individuo, en donde

(a) se determina el genotipo de al menos las SEQ ID NOs: 8, 11, 14, y 16, y opcionalmente también los SNP seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 10, 2, 3, 4, 6, 7, 12, 13 y... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar pérdida de impronta en el gen del Factor de Crecimiento Insulínico de tipo 2 (IGF2) de un individuo, donde elmétodo comprende detectar el genotipo del SNP del gen IGF2 en el individuo, en donde

(a) se determina el genotipo de al menos las SEQ ID Nos: 8, 11, 14, y 16, y opcionalmente también los SNP seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 1, 5, 9, 10, 2, 3, 4, 6, 7, 12, 13 y 15, o

(b) se determina el genotipo de almenoslas SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 y 16,

determinando de ese modo si el individuo es heterocigoto o homocigoto en cada uno de los SNP;

cuantificando en una muestra del individuo la cantidad de ARN que comprende dos opciones polimórficas de al menos un SNP heterocigoto;

determinando una relación de la cantidad de ARN que comprende dos opciones polimórficas de al menos un SNP heterocigoto; y correlacionando la relación de ARN con la pérdida de impronta del gen IGF2.

2. Método según la reivindicación 1, en donde la etapa de detección comprende detectar el genotipo del SNP de cada opción polimórfica de cada una de:

(i) SEQ ID NOs: 1, 5, 8, 9, 10, 11, 14, 15, y 16; o

(ii) SEQ ID NOs: 1, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, y 16; o

(iii) SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, y 16, o (iv) SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16.

3. Método según la reivindicación 1, en donde al menos un SNP adicional en la etapa de detección se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, y 6.

4. Método según la reivindicación 1, en donde la etapa de correlación además comprende correlacionar la cantidad relativa de ARN que comprende las opciones polimórficas de al menos un SNP heterocigoto con un aumento del riesgo de cáncer, un diagnóstico o pronóstico de cáncer, o una predicción de la eficacia de un fármaco para mejorar, tratar o prevenir el cáncer.

5. Método según la reivindicación 1, en donde al menos dos de los SNP detectados son heterocigotos y la etapa de cuantificación comprende cuantificar la cantidad de ARN que comprende dos opciones polimórficas en el al menos dos SNP heterocigotos.

6. Método según la reivindicación 1, en donde la muestra en una muestra de sangre, heces, raspado celular o de tejido.

7. Método según la reivindicación 1, en donde el ARN se transcribe de forma inversa en ADNc, y la cantidad de ADNcquecomprendecada opciónpolimórficaseutiliza paradeterminarla cantidad de ARNquecomprende lasdos opciones polimórficas.

8. Método según la reivindicación 7, en donde la cantidad de ADNc específico de alelo se cuantifica en un método que comprende poner en contacto el ADNc con almenos un polinucleótido de detección específica de alelo.

9. Método según la reivindicación 7, que comprende poner en contacto el ADNc con una cantidad suficiente de polinucleótidos de detección específicos de alelo, de tal manera que se determina la opción polimórfica para cada SNP heterocigota del grupo.

10. Método según la reivindicación 9, que comprende poner en contacto el ADNc con una cantidad de polinucleótidos diferentes de detección específicos de alelo, en donde la cantidad es igual o mayor que el número de SNP heterocigotos en el grupo, de tal manera que al menos un polinucleótido diferente de detección se utiliza para detectar diferentes SNP heterocigotos.

11. Método según la reivindicación 8, en donde el al menos un polinucleótido de detección específico de alelo hibrida con el ADNc extendido de manera dependiente delmolde a través de la posición polimórfica del SNP en el ADNc.

12. Método según la reivindicación 11, en donde el al menos un polinucleótido de detección específico de alelo

comprende al menos o nucleótidos contiguos en el extremo 3’ del polinucleótido de detección específico de alelo, en 5 donde los almenos 8 nucleótidos contiguosson o bien:

100% complementarios a al menos 8 nucleótidos directamente 3’ o tienen 2 o 3 nucleótidos 3’ de la posición polimórfica de una región SNPmostrada en el al menos un SNP heterocigoto; o 100% idénticos a al menos 8 nucleótidos directamente o tienen 2 o 3 nucleótidos 5’ de la posición del al menos un SNP heterocigoto.

13. Método según la reivindicación 8, en donde el al menos un polinucleótido de detección específico de alelo comprende una secuencia 100% idéntica a al menos 8 nucleótidos contiguos, o el complemento de los mismos, de al menos un SNP heterocigoto, y la secuencia consiste en al menos 8 nucleótidos contiguos, o el complemento de los mismos, del SNP, en donde una de las posiciones de la secuencia corresponde a la posición variable del SNP.

14. Método según la reivindicación 4, que además comprende proporcionar una clasificación de riesgo de cáncer,

diagnóstico de cáncer, o pronóstico en base a la etapa de correlación, y/o someter al individuo a un procedimiento de detección de enfermedades (por ejemplo, colonoscopia) en base a la etapa de correlación, y/o someter una muestra del individuo a ensayos diagnósticos o pronósticos adicionales basados en la etapa de correlación, y/o cambiar un fármaco u otro régimen de tratamiento del individuo en base a la etapa de correlación.