Célula hospedadora de Myceliophthora thermophila que expresa una enzima alfa-xilosidasa heteróloga y su uso en un procedimiento de degradación de biomasa.

Célula hospedadora de Myceliophthora thermophila que expresa una enzima alfa-xilosidasa heteróloga y su uso en un procedimiento de degradación de biomasa.

La presente invención se refiere a una célula hospedadora de Myceliophthora thermophila que expresa una alfa-xilosidasa, preferiblemente la alfa-xilosidasa Ataxi de Aspergillus terreus, el uso de esta célula hospedadora para la degradación de biomasa lignocelulósica y un procedimiento para la producción de bioetanol que comprende el uso de dicha célula hospedadora.

La invención se refiere al campo de los biocombustibles, y más particularmente, a la expresión de enzimas con actividad alfa-xilosidasa en células hospedadoras y su uso en la producción de bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica.

TÉCNICA ANTERIOR

La biomasa vegetal proporciona una fuente abundante de energía potencial en forma de azúcares que pueden utilizarse para numerosos procesos industriales y agrícolas y, por lo 15 tanto, es un importante recurso renovable para la generación de azúcares fermentadles, dado que la fermentación de estos azúcares puede producir productos finales comercialmente valiosos, tales como el bioetanol. Sin embargo, el enorme potencial energético de estos carbohidratos actualmente no se utiliza en su totalidad debido a que los azúcares están formando parte de polímeros complejos y, por lo tanto, no son fácilmente 20 accesibles para la fermentación (WO2012018691A2).

La madera, los residuos agrícolas, los cultivos herbáceos y los residuos sólidos urbanos se han considerado materias primas potenciales para la producción de etanol. Estos materiales contienen principalmente celulosa, hemicelulosa y/o lignina. Una vez que la celulosa se 25 convierte en glucosa por medio de un proceso hidrolítico enzimático o sacarificación, la glucosa se fermenta fácilmente por levaduras hasta etanol. Por lo tanto, cuanto mayor es la cantidad de azúcares complejos que permanecen al final del proceso hidrolítico menor es el rendimiento de la producción de etanol al final del proceso de fermentación. Por lo tanto, un área de investigación dirigida a disminuir los costes y mejorar el rendimiento de los procesos 30 de producción de biocombustible está centrada en la mejora de la eficacia técnica de las enzimas hidrolíticas que pueden usarse para generar azúcares fermentables a partir de la biomasa.

Debido a la complejidad de la biomasa, su conversión en azúcares monoméricos implica la acción de diferentes clases de enzimas, que digieren celulosa y hemicelulosa, polisacáridos principales comprendidos en los materiales celulósicos. El xiloglucano es, junto con el xilano, uno de los polisacáridos hemicelulolíticos principales presentes en la pared celular de 5 las plantas. Este polisacárido consiste en una cadena central de glucano (beta 1,4-glucosa), ramificada con sustituciones alfa 1,6-xilosa, a las que a su vez pueden unirse beta-galactosa y alfa-fucosa (Stephen C. Fry 1989, J. Exp. Bot. 40 (1): 1-11). Aunque las endo-xilanasas y las beta-xilosidasas son capaces de degradar el xilano hasta xilosa, la hidrólisis del xiloglucano requiere la acción combinada de varias enzimas, liberando como productos 10 finales azúcares fermentables, principalmente glucosa y xilosa.

Se ha demostrado que enzimas individuales son únicamente capaces de digerir parcialmente la celulosa y la hemicelulosa y, por lo tanto, se requiere la acción concertada de diferentes clases de enzimas para completar su conversión en azúcares monoméricos. 15 Se requieren muchas más enzimas para digerir la hemicelulosa hasta azúcares monoméricos que la celulosa, incluyendo enzimas con actividad xilanasa, beta-xilosidasa, arabinofuranosidasa, mananasa, galactosidasa y glucuronidasa. También pueden estar involucradas otras enzimas sin actividad glicosil hidrolasa, tales como acetil xilano esterasa y ácido ferúlico esterasa.

Se ha descubierto que un gran número de organismos de origen natural llevan a cabo la hidrólisis enzimática de los materiales celulósicos para producir azúcares fermentables. Los organismos capaces de realizar una degradación completa de celulosa y hemicelulosa, que posteriormente permita una fermentación eficiente, mejorarían en gran medida la 25 rentabilidad de la producción de bioetanol. Así, algunos esfuerzos realizados con el fin de generar mejores microorganismos que expresan enzimas celulolíticas, han implicado la inserción de un gen que codifica la enzima hidrolítica específica a expresar, bajo el control de fuertes señales de expresión, lo que da lugar a una mayor estabilidad de el ARNm transcrito o un aumento del número de copias del gen en el organismo producido 30 (US20080194005A1).

La eficiencia hidrolítica de un complejo multi-enzimático en el proceso de sacarificación

lignocelulósico depende tanto de las propiedades de las enzimas individuales como de la proporción de cada enzima presente en el complejo. Por lo tanto, es deseable generar microorganismos que expresen enzimas celulolíticas que mejoren el rendimiento del proceso de degradación del material lignocelulósico, incrementando la cantidad de azúcares 5 fermentables liberados y mejorando de esta manera el rendimiento de la producción de biocombustibles.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

10 La presente invención describe una célula hospedadora de Myceliophthora thermophila que expresa una alfa-xilosidasa recombinante, preferiblemente la alfa-xilosidasa AtaxI (SEQ ID NO: 2) de Aspergillus terreus. Esta célula hospedadora da lugar a un aumento de la eficiencia de la hidrólisis de material lignocelulósico en azúcares fermentables, más particularmente, mejorando la degradación de xiloglucano hasta xilosa. La invención 15 también proporciona un procedimiento de producción de bioproductos, preferiblemente, biocombustible, con dicha célula hospedadora o con la composición enzimática producida por ésta.

La presente invención representa una solución a la necesidad de disponer de un 20 microorganismo que exprese una mezcla de enzimas celulolíticas que mejore el rendimiento del proceso de degradación de la biomasa, aumentando la cantidad de azúcares fermentables liberados y mejorando así el rendimiento de la producción de biocombustible.

Aproximadamente el 20-30% de la xilosa presente en los polisacáridos constituyentes de la 25 biomasa lignocelulósica no se libera en el proceso de hidrólisis enzimática de la biomasa. La célula hospedadora de la invención expresa una alfa-xilosidasa capaz de participar en la degradación de xiloglucano hasta xilosa. Por lo tanto, esta célula hospedadora es útil para la optimización de la etapa de hidrólisis de la biomasa hasta azúcares fermentables.

30 Los inventores han demostrado que la mezcla enzimática producida por la célula hospedadora de M. thermophila de la invención, que expresa la alfa-xilosidasa heteróloga, da lugar a una mayor concentración de xilosa liberada a partir de xiloglucano que una

mezcla enzimática producida por una célula de M. thermophila que no expresa la alfa- xilosidasa heteróloga. Por lo tanto, la célula hospedadora de la invención es ventajosa puesto que su uso, o el uso de un cóctel enzimático producido por ésta, en un procedimiento de hidrólisis de material lignocelulósico, aumenta la concentración de azúcares fermentables 5 liberados a partir de biomasa lignocelulósica y, por lo tanto, el rendimiento total de la producción de biocombustible.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una célula hospedadora de M. thermophila que expresa una alfa-xilosidasa, de ahora en adelante "célula 10 hospedadora de la invención".

El término "alfa-xilosidasa" como se usa aquí, se refiere a una enzima que pertenece a la familia 31 de las glicosil hidrolasas y cataliza la liberación de alfa-xilosa unida a la glucosa terminal no reductora del xiloglucano.

Las alfa-xilosidasas que pueden expresarse en la célula hospedadora de la invención son, por ejemplo, las producidas por microorganismos tales como bacterias (Larsbrink y col., 2011) u hongos, preferiblemente hongos, más preferiblemente hongos del género Aspergillus. Por lo tanto, en una realización más preferida, la alfa-xilosidasa se obtiene a 20 partir de un microorganismo del género Aspergillus. En una realización aún más preferida, el hongo Aspergillus es Aspergillus terreus. Una alfa-xilosidasa de A. terreus es, por ejemplo, la enzima madura SEQ ID NO: 2.

En otra realización preferida, la alfa-xilosidasa expresada por la célula hospedadora de la 25 invención, comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 70%, 76%, 79%, 80%, 83%, 85%, 90%, 95% o 99% idéntica a la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, la alfa- xilosidasa expresada por la célula hospedadora de la invención comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 76% idéntica a la SEQ ID NO: 2. Ejemplos de alfa- xilosidasas que son al menos un 70% idénticas a la SEQ ID NO: 2 son alfa-xilosidasas de 30 Aspergillus flavus (número de acceso al GenBank XP_002378848.1, 84% idéntica a la SEQ ID NO: 2), A. oryzae (número de acceso al GenBank EIT81731.1, 84% idéntica a la SEQ ID NO: 2), A. oryzae (número de acceso al GenBank XP_001823456.1, 84% idéntica a la SEQ

ID NO: 2), Neosartorya... [Seguir leyendo]

1. Una célula hospedadora de Myceliophthora thermophila que expresa una alfa-xilosidasa.

5 2. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la alfa-xilosidasa comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 76% idéntica a la SEQ ID NO:

2.

3. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la alfa-xilosidasa se 10 obtiene a partir de un microorganismo del género Aspergillus.

4. La célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en la que la alfa-xilosidasa comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2.

15 5. La célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha célula hospedadora es la cepa C1 de Myceliophthora thermophila.

6. Una composición que comprende la célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende adicionalmente otras enzimas celulolíticas.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en la que las otras enzimas 25 celulolíticas se seleccionan de la lista que consiste en: endoglucanasas, beta-glucosidasas,

celobiohidrolasas, beta-xilosidasas, endoxilanasas, endoxiloglucanasas o cualquier combinación de las mismas.

9. Uso de la célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o 30 de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para la

degradación de biomasa.

10. Uso, de acuerdo con la reivindicación 9, para la degradación de biomasa en un proceso de producción de un bioproducto.

11. Uso, de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el bioproducto es bioetanol.

12. Un procedimiento de producción de azúcares fermentables que comprende:

a) Incubar biomasa con la célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 5, o con la composición de acuerdo con cualquiera de las

10 reivindicaciones 6 a 8, y

b) Recuperar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación en la etapa (a).

13. Un procedimiento de producción de un bioproducto a partir de biomasa que comprende: 15

a. Incubar biomasa con la célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 5, o con la composición de acuerdo con cualquiera de las

reivindicaciones 6 a 8, para provocar la hidrólisis enzimática de dicha biomasa,

b. Fermentar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la

20 etapa (a) con al menos un microorganismo termentador, y

c. Recuperar el bioproducto obtenido después de la fermentación en la etapa (b).

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el bioproducto es bioetanol.