Célula genéticamente modificada y procedimiento de uso de dicha célula.

Célula modificada genéticamente que comprende:

(i) una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un primer polipéptido que tiene capacidades de transporte de ácido 5-(hidroximetil)furan-2-carboxílico (ácido HMF),

que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID Nº 1, 2, 3 o 4; e

(ii) una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un segundo polipéptido que tiene actividad convertidora de ácido HMF;

caracterizado porque dicha célula es modificada genéticamente mediante la introducción funcional de al menos la primera secuencia de polinucleótidos y, preferentemente, mediante la introducción funcional de la primera y la segunda secuencia de polinucleótidos.

detallada de ¡a invención

Definiciones generales

A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprenden" e "incluyen" y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "Incluye" y "que Incluye" deben interpretarse de forma incluyente. Es decir, estas palabras tienen como objetivo transmitir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no citados específicamente, cuando el contexto lo permita.

Los artículos "un/uno" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a

uno o a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un

elemento o más de un elemento.

El término "una serle de" debe entenderse que tiene el significado de uno o más.

En el presente documento se entiende que los compuestos furánicos son cualquier compuesto que tiene un anillo de furano. Preferentemente, el compuesto furánlco es un compuesto que puede oxidarse a ácido 2,5-furan- dicarboxílico. Los compuestos furánicos relevantes en el contexto de la presente invención incluyen [5- (hidroximet¡l)furan-2-¡l]metanol ("alcohol HMF"), 5-(hidroximetil) furan-2-carbaldehído ("HMF"), ácido 5- (hidroximet¡l)furan-2-carboxíl¡co ("ácido HMF"), ácido 5-formilfurano-2-carboxílico ("FFA"), furano-2,5-dicarbaldehído (DFF) y ácido furano-2,5-dlcarboxílico ("FDCA"). El anillo de furano o cualquiera de sus grupos laterales sustituibles pueden estar sustituidos, por ejemplo, con OH, alquilo C1-C10, alquilo, alilo, arilo o RO- resto éter, incluyendo grupos cíclicos, en cualquier posición disponible en el anillo furano. Las estructuras químicas de un número de compuestos furánicos relevantes se presentan a continuación.

El término "polinucleótido" incluye ácidos polidesoxirribonucleicos (ADN) y ácidos polirribonucleicos (ARN) y el término puede referirse a ADN o ARN. El experto será consciente de las diferencias en la estabilidad de las

moléculas de ADN y ARN. Así, el experto en la técnica será capaz de entender a partir del contexto del uso del término "polinucleótido", cuál de las formas de polinucleótido (ADN y / o ARN) es adecuada.

El término "similitud" secuencia tal como se utiliza en el presente documento se refiere a la medida en que las secuencias de polinucleótidos o de proteínas individuales son ¡guales. El grado de similitud entre dos secuencias se basa en la medida de la identidad combinada con la medida de los cambios conservadores. El porcentaje de "similitud de secuencia" es el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que es o bien idéntico o con cambios conservadores a saber "similitud de secuencia" = (% de Identidad de secuencia) + (% cambios conservadores).

Para el propósito de la presente invención "cambios conservadores" e "identidad" se consideran especies del término más amplio "similitud". De esta manera, cada vez que se utiliza el término "similitud" de secuencia, abarca la "identidad" de secuencia y los "cambios conservadores".

La expresión "identidad de secuencia" es conocida para el experto en la técnica. Con el fin de determinar el grado de identidad de secuencia compartida por dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, se alinean las secuencias para fines comparativos óptimos (p. ej., se pueden introducir espacios en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). Dicha alineación puede llevarse a cabo sobre las longitudes completas de las secuencias que se están comparando. Como alternativa, la alineación puede llevarse a cabo sobre una longitud más corta de comparación, por ejemplo por encima de aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos / bases o aminoácidos.

Después se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácidos o nucleótido en la correspondiente posición en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en dicha posición. El grado de identidad compartida entre las secuencias normalmente se expresa en términos del porcentaje de identidad entre las dos secuencias y es función del número de posiciones idénticas compartidas por residuos idénticos en las secuencias (es decir, % de identidad= número de residuos idénticos en las posiciones correspondientes/número total de posiciones x 100). Preferentemente, las dos secuencias que se están comparando son de la misma o sustancialmente la misma longitud.

El porcentaje de "cambios conservadores" se puede determinar de forma similar al porcentaje de identidad de secuencia. Sin embargo, en este caso, los cambios en un lugar específico de una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que son propensos a conservar las propiedades funcionales de los residuos originales se puntúan como si se hubiera producido ningún cambio.

Para las secuencias de aminoácidos, las propiedades funcionales relevantes son las propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos. Una sustitución conservadora para un aminoácido en un polipéptido de la invención se puede seleccionar de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica de la bioquímica de las proteínas que un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular (tales como carga, hidrofobicidad e hidrofilicidad) puede ser sustituido por otro aminoácido sin alterar la actividad de una proteína, particularmente en regiones de la proteína que no están directamente asociadas con la actividad biológica. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisterna, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones conservadoras incluyen, por ejemplo, Lys porArg y viceversa para mantener una carga positiva; Glu por Asp y viceversa para mantener una carga negativa; Ser por Thr de manera que se mantenga un -OH libre; y Gln por Asn para mantener un -NH2.libre.

Para las secuencias de nucleótidos, las propiedades funcionales pertinentes es principalmente la información biológica que un determinado nucleótido lleva dentro del marco de lectura abierto de la secuencia en relación con la transcripción y / o maquinaria de traducción. Es de conocimiento común que el código genético tiene degeneración (o redundancia) y que múltiples codones pueden llevar a la misma información con respecto al aminoácido que codifican. Por ejemplo, en ciertas especies del aminoácido leucina está codificado por los codones UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, los CUG (o TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG para el ADN)y el aminoácido serina está especificado por UCA , UCG, UCC, UCU, AGU, AGC (o TCA, TCG, TCC, TCT, AGT, AGC para el ADN). Los cambios de nucleótidos que no alteran la información traducida se consideran cambios conservadores.

El experto en la técnica conocerá el hecho de que varios programas de ordenador diferentes, utilizando diferentes algoritmos matemáticos, están disponibles para determinar la identidad entre dos secuencias. Por ejemplo, se puede hacer uso de un programa de ordenador que emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y col., (1970)). De acuerdo con una forma de realización, el programa de ordenadores el programa GAP en el paquete de software GCG Accelerys (Accelerys Inc., San Diego EE UU ). Las matrices de sustitución que se pueden usar son, por ejemplo una matriz BLOSUM 62 o una matriz PAM250, con un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El experto en la técnica apreciará que todos estos parámetros diferentes

producirán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan algoritmos diferentes.

De acuerdo con una realización, el porcentaje de Identidad entre dos secuencias de nucleótldos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG Accelrys (Accelerys Inc., San Diego EE.UU.). Se usa una matriz NWSgapdna CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

En otra realización, el porcentaje de Identidad de dos secuencias... [Seguir leyendo]

1. Célula modificada genéticamente que comprende:

(I) una primera secuencia de pollnucleótldos que codifica un primer polipéptido que tiene capacidades de transporte de ácido 5-(hidrox¡met¡l)furan-2-carboxílico (ácido HMF), que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID N° 1, 2, 3 o 4; e

(II) una segunda secuencia de pollnucleótldos que codifica un segundo polipéptido que tiene actividad convertidora de ácido HMF;

caracterizado porque dicha célula es modificada genéticamente mediante la introducción funcional de al menos la primera secuencia de pollnucleótldos y, preferentemente, mediante la introducción funcional de la primera y la segunda secuencia de pollnucleótldos.

2. La célula modificada genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el segundo polipéptido es una ácido 5-(hldrox¡met¡l)furan-2-carboxíllco oxldorreductasa, preferentemente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID N° 5 o 6.

3. Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que la primera secuencia de pollnucleótldos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID N°7, 8, 9 o 10.

4. Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la segunda secuencia de pollnucleótldos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID N° 11 o 12.

5. Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una tercera secuencia de pollnucleótldos que codifica un tercer polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 % más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID N° 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25.

6. Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la tercera secuencia de pollnucleótldos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID N° 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32.

7. Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la célula es una célula procariota tal como una célula bacteriana o una célula eucarlota, tal como una célula de levadura, una célula fúnglca, una célula vegetal o una célula animal.

8. Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la célula es una célula procariota, preferentemente una célula bacteriana seleccionada de los géneros Escber/cb/a, Anabaena, Cau/oóacfer, G/uconobacter, R/?odoóacfer, Pseudomonas, Paracoccus, Bac///us, Brev/óacfer/um, Co/yneóacfen'um, Fb/zob/um fS/nod?/zoó/um,), Sradyr/i/'zoó/'um, F/avobacter/um, K/ebs/e//a, Enferoóacfer, Lacfoóac///us, Lacfococcus, Mef/?y/oóacfen'um, Stapby/ococcus, Streptomyces, Zymomonas, Acefobacfer, Streptococcus, Bactero/des, Se/enomonas, Megaspbaera, Bur/rbo/der/a, Cupn'av/dus, Fa/sfon/a,

Mefby/obacfer/um, Metby/ovorus, F/iodopseudomonas, /4c/d/p/?///um, D/noroseobacter, Agroóacfer/um, Su/fb/obus o Sp/7/ngomonas, más preferentemente seleccionada del grupo que consiste en Bac/V/us sudt/7/s, Bac/V/us amy/o//guefac/ens, Bac/V/us //cben/fbrm/s, Bac///us punf/'s, Bac///us megater/um, Bac///us ba/odurans, Bac///us pum//us, G/uconobacter oxydans, Cau/obacter crescentus, Metby/obacter/um exforguens, Metby/obacter/um rad/oto/erans, Mef/iy/obacfen'um nodu/ans, Fbodobacter spbaero/des, Pseudomonas zeaxanfb/n/fac/ens, Pseudomonas puf/da, Pseudomonas puf/da S12, Paracoccus den/fr/t/cans, Escben'cb/a co//, Co/ynebacter/um g/ufam/cum, Stapby/ococcus carnosus, Sfrepfomyces //v/dans, S/norb/zob/um me///of/, Bradyrb/zob/um japon/cum, Fb/zob/um rad/obacter, Fb/zob/um /egum/nosarum, Fb/zob/um /egum/nosarum bv. fufo///, Agrobacfer/um rad/obacter, Cupr/av/dus bas//ens/s, Cupn'av/dus necator (Fa/sfon/a eufropba), Fa/ston/a p/c/rett//, Bur/rbo/der/a pbytot/rmans, Bur/rbo/den'a pbymatum, Bur/(bo/der/a xenovorans, Bur/rbo/den'a gram/n/s,

R/iodopseudomonas paZt/sZbs, 4c/d/pb/7/um c/ypfum, D/noroseobacter sb/bae, SuZZoZobus ac/docaZdar/bs, St/ZZoZobt/s /sZand/ct/s, Su/Zo/obus so/ZaZancus, Su/Zo/obus ZoZ<oda//.

9. Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la célula es

una célula huésped eucariota, por ejemplo una célula de mamífero, de insecto, vegetal, fúngica o de alga, tal como una célula de mamífero seleccionada de células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células 293, células PerC6 o hibridomas, una célula de insecto seleccionada de células Sf9 o Sf21 y derivadas de los mismos, preferentemente una célula eucariota seleccionada de células fúngicas o de levadura, tales como especies de Candida, FZansent/Za, Z</uyveromyces, P/cb/a, Saccbaromyces, Scb/zosaccbaromyces o Yarrow/a, con mayor preferencia una célula eucariota seleccionada de Z<Zt/yvero/nyces /acf/s, Saccbaromyces cerev/s/ae, ZZa/zsent/Za poZymorpba, Yarrow/a Z/poZyZZca, P/cb/a sZ/p/ZZs o P/cb/a pasZor/s o una célula de hongo filamentoso de una especie seleccionada de la subdivisión Et/mycofa y Oomycota o, como alternativa, una especie del género /ícremo/i/bm, 4gabcus, 4sperg/7Zus, 4ureobas/d/u/T?, Cbrysospobum, Copb/ius, C/ypfococct/s, P/7/bas/d/Pm, Pusar/Pm, Z7t/m/coZa, Magr/aporZbe, Mucor, ZMyceZZopbZbora, ZVeocaZZZmasZZx, ZVet/rospora, Paec/Zomyces, Pen/'c/ZZ/Pm, P/romyces, Pbar/erocbaeZe, PZet/roft/s, Scb/zopbyZZt/m, ía/aromyces, íbermoasct/s, íb/eZav/a, 7o/ypoc/ad/P/7? o Ybcboderma tal como 4sperg/7Zus n/ger, /ísperg/ZZus awarnor/, TíspergZZZt/s ZoeZ/dus, Psperg/7/us so/ae, 4sperg/7Zus Zí/m/gaZus, ía/aromyces emersor///, 4sperg/7Zus o/yzae, Cb/ysospor/Pm ZucZmowense, ír/cboderma reese/' o Pen/'c/ZZ/Pm cb/ysoge/ium.

10. Una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la primera y la segunda secuencia de polinucleótidos se localizan en un único vector opcionalmente un vector que además comprende la tercera secuencia de polinucleótidos.

11. Un vector que comprende:

(i) una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un primer polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID N° 1 , 2, 3 o 4; y

(¡i) una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un segundo polipéptido que tiene actividad convertidora de ácido 5-(hidroximet¡l)furan-2-carboxíl¡co (ácido HMF).

12. Un vector de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el segundo polipéptido es una ácido 5- hidroximetilfuroico oxidorreductasa, preferentemente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en la SEC ID N° 5 o 6.

13. Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en la que la primera secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID N° 7, 8, 9 o 10.

14. Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en la que la segunda secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID N° 11 o 12.

15. Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-14, que comprende una tercera segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un tercer polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de nucleótidos definida en las SEC ID N° 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25.

16. Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en la que la tercera secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 45 %, preferentemente al menos 60 %, tal como al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 %, tal como 90 %, más preferentemente al menos 95 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida en las SEC ID N° 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32.

17. Procedimientos para convertir el ácido 5-(hidroximet¡l)furan-2-carboxíl¡co (ácido HMF) que comprenden incubar una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en presencia de ácido HMF en condiciones adecuadas para la conversión por dicha célula del ácido HMF.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el ácido HMF es formado in situ a partir de uno o más precursores furánicos de ácido HMF en condiciones adecuadas para la conversión por dicha célula del uno o más precursores furánicos en ácido HMF.

19. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-18, en el que el segundo polipéptldo de la célula es una ácido HMF oxldorreductasa y que además comprende someter la célula a condiciones adecuadas para la conversión de ácido HMF en FDCA.

20. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en el que un precursor furánlco es seleccionado del grupo que comprende ácido 5-(hldrox¡met¡l)furan-2-carbaldehído (HMF), furan-2,5-

dlcarbaldehído (DFF), [5-(h¡drox¡metll)furan-2-ll]metanol (alcohol HMF) y es, preferentemente, HMF.

21. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-20, en el que un precursor furánico es obtenido a partir de uno o más azúcares hexosa, preferentemente uno o más azúcares hexosa obtenidos de blomasa llgnocelulósica, por ejemplo mediante deshldrataclón catalizada por ácido.

22. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-21, en el que el FDCA es recuperado de la

mezcla de reacción mediante un procedimiento que comprende precipitación en ácido, seguido de cristalización por enfriamiento o, como alternativa, seguido de extracción en disolvente.

23. Uso de una célula modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para la blotransformaclón de una serle de precursores furánicos en FDCA.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el número de precursores furánicos es seleccionado del

grupo que comprende 5-(hldroximet¡l) furan-2-carbaldehído (HMF), [5-(hidrox¡met¡l)furan-2-¡l]metanol (alcohol HMF), ácido 5-(hldroxlmet¡l) furan-2-carboxíllco (ácido HMF) furan-2,5-dicarbaldehído (DFF) o ácido 5- formilfuran-2-carboxíllco (FFA).