Catalasa termoestable.

Una proteína seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1-692 de la SEC ID Nº:

2;

(ii) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se eliminaron, sustituyeron o añadieron de 1 a 50 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1-692 de la SEC ID Nº: 2, y que tiene una actividad catalasa termoestable; y

(iii) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 80 % o más con la que consiste en los aminoácidos 1-692 de la SEC ID Nº: 2, y que tiene una actividad catalasa termoestable.

Catalasa termoestable Campo técnico

La presente invención se refiere a catalasas termoestables, más en particular, a catalasas termoestables derivadas de Penicillium pinophilum, a proteínas que tienen una actividad catalasa termoestable, a los ADN que codifican las proteínas y a un procedimiento para producir las catalasas termoestables.

Técnica anterior

La catalasa es una enzima que cataliza una reacción en la que el peróxido de hidrógeno se descompone en agua y oxígeno. La solución acuosa de peróxido de hidrógeno se usa ampliamente como antiséptico o desinfectante. Después de completar la desinfección, la solución de peróxido de hidrógeno se puede retirar fácilmente con agua y se descompone espontáneamente a medida que avanza el tiempo y, por lo tanto, se usa ampliamente como desinfectante para alimentos. Sin embargo, se desea que el peróxido de hidrógeno se descomponga por completo y se retire después de su uso, porque las especies reactivas del oxígeno generadas a partir del peróxido de hidrógeno restante pueden provocar envejecimiento celular o cáncer. La catalasa es extremadamente útil para la descomposición del peróxido de hidrógeno, porque no se necesitan sustancias químicas adicionales para la descomposición. De hecho, la catalasa se usa para la descomposición y la retirada de la peroxidasa de hidrógeno restante después del blaqueamiento del algodón o en los alimentos. Se conocen catalasas derivadas de microorganismos (referencias de patente 1 a 5) y catalasas derivadas de animales, tales como la catalasa hepática porcina o bovina.

Entre estas catalasas conocidas, la catalasa producida por un hongo filamentoso Aspergillus niger o la catalasa hepática porcina se usan ampliamente para usos industriales. Sin embargo, se sabe que estas catalasas presentan una termoestabilidad baja y que la actividad restante de las mismas después del tratamiento a 70 °C durante 30 minutos era de aproximadamente el 10 % (referencia de patente 6). En particular, para el uso del procesamiento textil, el procesamiento de alimentos o similares, se desea que la catalasa tenga una termoestabilidad superior a la de esas catalasas convencionales, porque el peróxido de hidrógeno se tiene que descomponer a una temperatura superior. Como catalasas termoestables, se ha informado de las catalasas producidas por Aspergillus terreus (referencia de patente 6), Acremonium alabamensis (referencia de patente 6), Thermoascus aurantiacus (referencia de patente 6), Scytalidium thermophilum (referencia de patente 7), Humicola insolens (referencia de patente 7) y el género Thermomyces (referencia de patente 8).

Se sabe que los hongos filamentosos tienen una actividad secretora de proteínas extremadamente alta y que son adecuados como huéspedes para producir una proteína recombinante tal como las enzimas. Por lo tanto, si se puede introducir un gen de catalasa termoestable en un hongo filamentoso y se puede expresar altamente la catalasa termoestable como proteína recombinante, se espera poder producir la catalasa termoestable con una productividad extremadamente alta en comparación con una de tipo natural. Con respecto a la producción de proteínas recombinantes, se ha informado de que las proteínas recombinantes se podrían producir en hongos filamentosos clasificados en los géneros Aspergillus (referencia de patente 9), Penicillium (referencia de patente 10), Humicola (referencia de patente 11), Trichoderma (referencia de patente 12) o Acremonium (referencia de patente 13).

Cuando se expresa una proteína recombinante en estos hongos filamentosos como huésped, no todos los genes exógenos introducidos en el huésped se expresan necesariamente. En general, se considera preferente que el origen de un gen exógeno que se va a introducir tenga una relación lo más estrecha posible con el del huésped, con vista al uso de codones. Por ejemplo, en el caso en que se utilizó Humicola insolens como huésped para expresar endoglucanasa como proteína recombinante, se expresó una cantidad significativa de endoglucanasa al introducir un gen NCE4 o NCE5 derivado de Humicola insolens en Humicola insolens (referencias de patente 14 y 15). En contraste, se expresó una cantidad pequeña de endoglucanasa al introducir un gen RCE I, derivado de Rhizopus oryzae y que tenía una secuencia de aminoácidos que mostraba una identidad alta con las de NCE4 y NCE5, en Humicola insolens (referencia de patente 16). Además, en el caso en que se usó Aspergillus awamori como huésped para expresar glucoamilasa como proteína recombinante, la introducción de un gen de glucoamilasa derivado de Aspergillus niger dio lugar a una productividad alta (4,6 g/l), pero la introducción de un gen de glucoamilasa derivado de Humicola grísea dio lugar a una productividad baja (0,66 g/l) (referencia que no es una patente 1). Por otra parte, en el caso en el que se expresó a-amilasa como proteína recombinante, la introducción de un gen de a-amilasa derivado de Aspergillus oryzae en Aspergillus oryzae como huésped dio lugar a una productividad alta (12 g/l), pero la introducción del gen de a-amilasa derivado de Aspergillus oryzae en Trichoderma viride dio lugar a una productividad de tan solo 1 g/l (referencia que no es una patente 1). Estos resultados demuestran que, cuando se va a expresas una cantidad significativa de proteína recombinante, es preferente introducir un gen derivado de un hongo filamentoso que es de la misma especie que el huésped o de una relacionada.

Cuando se usa un hongo filamentoso como huésped para expresar una gran cantidad de catalasa termoestable como proteína recombinante, se considera preferente que el origen de un gen de catalasa que se va a introducir esté

estrechamente relacionado con el del hongo filamentoso usado como huésped, como se describe anteriormente. Sin embargo, con respecto al aislamiento de genes de catalasa termoestable, solo se ha informado de un gen de catalasa derivado de Thermoascus aurantiacus (referencia de patente 17) y un gen de catalasa derivado de Scytalidium thermophilum (referencia de patente 18). No se han aislado genes de catalasa termoestable de hongos 5 filamentosos desarrollados como huéspedes para la producción de proteínas, tales como los de los géneros Aspergillus, Penicillium, Humicola, Tríchoderma o Acremonium, y, por lo tanto, era muy difícil expresar la catalasa termoestable como proteína recombinante con productividad alta.

[referencia de patente 1] Publicación de patente japonesa pendiente de examen (kokai) N.° 55-135588

[referencia de patente 2] Publicación de patente japonesa pendiente de examen (kokai) N.° 60-083579

10 [referencia de patente 3] Publicación de patente japonesa pendiente de examen (kokai) N.° 63-003788

[referencia de patente 4] Publicación de patente japonesa examinada (kokoku) N.° 49-004956 [referencia de patente 5] Publicación de patente japonesa pendiente de examen (kokai) N.° 2-076579

[referencia de patente 6] Publicación de patente japonesa pendiente de examen (kokai) N.° 5-153975

[referencia de patente 7] Publicación de traducción japonesa (Kohyo) N.° 6-506347 15 [referencia de patente 8] Publicación de patente japonesa pendiente de examen (kokai) N.° 10-257883

[referencia de patente 9] Publicación internacional WO 97/034004 [referencia de patente 10] Publicación internacional WO 2000/068401 [referencia de patente 11] Publicación internacional WO 98/003667 [referencia de patente 12] Publicación internacional WO 98/011239 20 [referencia de patente 13] Publicación de patente japonesa pendiente de examen (kokai) N.° 2001/017180

[referencia de patente 14] Publicación internacional WO 98/003640 [referencia de patente 15] Publicación internacional WO 2001/090375 [referencia de patente 16] Publicación internacional WO 2000/024879

[referencia de patente 17] Publicación de patente japonesa pendiente de examen (kokai) N.° 2004-261137 25 [referencia de patente 18] Patente de Estados Unidos N.° 5646025 [referencia que no es una patente 1] Norihiro

TSUKAGOSHI, Kumikae Tanpakushitsu Seisan-hou (Production of recombinant proteins), Japan Scientific Societies Press, págs. 94-95

Divulgación de la invención

Problemas que debe solucionar la invención

30 En determinadas circunstancias se desea la expresión de una gran cantidad de catalasa termoestable como proteína recombinante. Un objetivo que deben resolver los presentes inventores es la búsqueda de hongos filamentosos pertenecientes a los géneros Aspergillus, Penicillium, Tríchoderma y Acremonium, que se desarrollaron como huéspedes para producir proteínas recombinantes, para catalasas termoestables; aislar genes que codifican las catalasas termoestables; y expresar las catalasas termoestables en... [Seguir leyendo]

1. Una proteína seleccionada del grupo que consiste en:

(I) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1-692 de la SEC 5 ID N°: 2;

(ii) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se eliminaron, sustituyeron o añadieron de 1 a 50 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1-692 de la SEC ID N°: 2, y que tiene una actividad catalasa termoestable; y

(iii) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 80 % o más con la

10 que consiste en los aminoácidos 1-692 de la SEC ID N°: 2, y que tiene una actividad catalasa termoestable.

2. Un ADN seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un ADN que codifica la proteína según la reivindicación 1; y

(ii) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1-2403 de la SEC ID N°: 1.

15 3. El ADN según la reivindicación 2, en el que se escinde del ADN una secuencia intrónica.

4. El ADN según la reivindicación 3, en el que la secuencia intrónica es una o más secuencias seleccionadas de la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 322-372, 599-651, 1068-1113 o 1279-1326 de la SEC ID N°: 1.

5. El ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que del ADN se escinde una secuencia de 20 nucleótidos que codifica una secuencia señal.

6. El ADN según la reivindicación 5, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal es la que consiste en los nucleótidos 1-126 de la SEC ID N°: 1.

7. Un vector de expresión que comprende el ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.

8. Un microorganismo huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 7.