Bacteria genéticamente modificada de la especie Listeria monocytogenes.

Una bacteria genéticamente modificada de la especie Listeria monocytogenes,

en la que se ha delecionado el locus genómico del factor de transcripción PrfA, caracterizada porque a nivel genómico contiene una secuencia artificial que actúa como control interno de amplificación (IAC).

Bacteria genéticamente modificada de la especie Listeria monocytogenes

La presente invención se refiere a una bacteria genéticamente modificada de la especie Listeria monocytogenes, en la que se ha delecionado el locus genómico del factor de transcripción PrfA, que se caracteriza porque a nivel genómico contiene una secuencia artificial que actúa como control interno de amplificación, el uso de esta bacteria, así como un método para detectar y determinar cualitativa y/o cuantitativamente la presencia de Listeria monocytogenes de tipo salvaje en una muestra que se sospecha está contaminada con dicho microorganismo y un kit.

Antecedentes de la invención:

Listeria monocytogenes es una bacteria gram positiva patógena que causa la listeriosis y es uno de los patógenos más virulentos transmitidos por los alimentos.

La detección de patógenos en muestras, por ejemplo en muestras de alimentos o muestras clínicas como sangre, tejidos o heces es cada vez más importante. No obstante, para identificar con claridad y, opcionalmente, cuantificar las células contenidas en una muestra deben proporcionarse métodos fiables para su detección y

cuantificación.

Desde la primera implementación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), esta herramienta de biología molecular se ha desarrollado como un método que proporciona muchas oportunidades para mejorar la detección de microorganismos.

Un requisito previo importante para que los métodos basados en la PCR se conviertan en patrones reconocidos a nivel internacional es el control interno de amplificación (IAC, por sus siglas en inglés). Un IAC es una secuencia de ADN no diana presente en el mismo tubo de muestra que se coamplifica de forma simultánea con la secuencia diana. En una PCR sin IAC, un resultado negativo no es definitivo ya que puede significar no solo que no había secuencia diana presente sino también que la reacción de amplificación se inhibió por diversos factores. Por tanto, el Comité Europeo de Normalización en colaboración con la Organización Internacional de Normalización (ISO, por sus siglas en inglés) propuso una directriz general para la PCR diagnóstica que requería la presencia de un IAC (ISO/DIS 22174).

El IAC debe ser competitivo al usar los mismos sitios de unión del cebador que la PCR diana y claramente distinguible de los amplicones del ADN diana gracias a su longitud y la longitud de onda de fluorescencia del colorante sonda usado en la PCR en tiempo real. En resumen, las características del control deberán ser lo más parecidas posible a las características de la diana garantizando, sin embargo, una interferencia insignificante con

la detección de la diana.

La implementación de un IAC en los ensayos de PCR garantiza la fiabilidad de los resultados negativos; sin embargo, esto es cierto únicamente para la reacción enzimática que facilita la amplificación de la diana en la PCR y para la reacción de detección cuantitativa y de confirmación basada en el uso de sondas fluorescentes en la PCR en tiempo real. Sin embargo, los pasos metódicos preliminares, como la preparación de la muestra y el aislamiento/purificación del ADN de la matriz de muestras no están cubiertos por este tipo de controles y si acaso, han de ser comprobados mediante controles externos. Esto no permite el control de muestras individuales y, por tanto, los resultados negativos implican la posibilidad de una verificación falsa del estado patogénico de las muestras investigadas, por ejemplo, alimentos.

Por tanto, es necesario un control interno del proceso de la muestra (CIPM) que debe cubrir todas los pasos metódicos necesarios para una detección cuantitativa fiable de patógenos con una PCR convencional o en tiempo real

Para la detección de virus de ARN transmitidos por los alimentos y el agua se ha publicado el uso de Calcivirus felino y el bacteriófago MS2 como controles internos (Mattison y col. [29] Int. J. Food Microbiol. 132, 73-77; Di y col. [21] J. Vi rol. Methods 165, 57-63; Dreiery col. [25] J. Clin. Microbiol. 43, 4551-4557).

Murphy y col. (27, Int. J. Food Microbiol. 12, 11-119) describen un control interno del proceso de la muestra bacteriano para la detección de Listeria monocytogenes y Salmonella entérica. Este control se basa en una cepa de E. coli recombinante que Incluye fragmentos del gen de fluorescencia verde (gfp) y del gen iroB de S. entérica. El control no se usaba con fines cuantitativos y la cepa de E. coli gram negativa subyacente mostraría características diferentes durante la preparación de la muestra en comparación con L. monocytogenes.

Por consiguiente, existe la necesidad de nuevos métodos fiables que permitan la detección y cuantificación del patógeno Listeria monocytogenes mediante PCR en tiempo real en muestras contaminadas.

De forma inesperada, se ha encontrado que este problema puede resolverse usando una cepa L. monocytogenes EGDe IAC+, A-prfA como control interno del proceso que cubra el proceso de detección completo.

Descripción de la invención

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención es una bacteria genéticamente modificada de la especie Listeria monocytogenes, en la que se ha delecionado el locus genómico del factor de transcripción PrfA, caracterizada porque a nivel genómico contiene una secuencia artificial que actúa como control interno de amplificación (IAC).

Una bacteria genéticamente modificada de la especie Listeria monocytogenes indica una especie de Listeria monocytogenes resultante de la alteración de su material genético usando técnicas de ingeniería genética. La modificación genética comprende la inserción y/o deleción de genes. La deleción del gen prfA puede, por ejemplo, conseguirse como se describe en Bóckmann y col. (1996) Mol. Microbiol. 22, 643-653.

El locus genómico del factor de transcripción PrfA constituye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína PrfA. Esta es una secuencia de 75 pares de bases (Leimeister-Wáchter y col., 199; Proc Nati Acad Sci USA, 87, 8336-4; Glaser y col., 21; Science, 294, 849-52). El gen se localiza dentro de la región cromosómica que rodea al gen de la listeriolisina (//sA) de L. monocytogenes (n.° de identificación del gen: 98731; http://www.ncbi.nlm.nih.goV/gene/98731#pagefop ). También se proporciona información relacionada con el factor de transcripción PrfA en Scortti y col. (27) Microbes and Infection 9, 1196-127, que se incorpora a este documento como referencia. PrfA controla la expresión de determinantes de virulencia clave de Listeria monocytogenes. PrfA es una proteína con 237 restos de 27 kDa. La deleción del locus genómico del factor de transcripción PrfA hace que el muíante no sea patógeno.

Según la presente invención, por control interno de amplificación (IAC) se entiende una secuencia de ácido nucleico artificial presente en el tubo de muestra durante la reacción de PCR y que se coamplifica con una determinada secuencia diana como se define en Hoorfar y col. (23) Lett. Appl. Microbiol. 38, 79-8. La presencia de un IAC permite determinar resultados falsos negativos. La secuencia IAC puede ser cualquier secuencia polinucleotídica. El tamaño de esta secuencia puede variar dependiendo del ensayo de PCR específico y de las condiciones de reacción del mismo.

La secuencia IAC es preferiblemente una secuencia de nucleótidos de copia única es decir, una secuencia de nucleótidos presente solo una vez en el genoma haploide de una bacteria Listeria monocytogenes.

Preferiblemente la secuencia IAC es una secuencia que no aparece en Listeria monocytogenes ni en ninguna de las demás especies que se prevé aparezcan de forma natural dentro de una muestra que se va a estudiar o en la propia matriz de muestras.

Preferiblemente, la secuencia IAC contiene secuencias de unión al cebador en los extremos 5' y 3'.

Según la presente invención se prefiere que el IAC sea un IAC competitivo, es decir, el IAC de la Listeria monocytogenes genéticamente modificada y la secuencia diana prfA de la Listeria monocytogenes de tipo salvaje se amplifican con un conjunto de cebadores común en las mismas condiciones y en el mismo tubo de PCR durante la PCR en tiempo real.

Por tanto, preferiblemente, las secuencias de unión al cebador del IAC son, en particular, idénticas a las secuencias de unión al cebador del locus prfA de la Listeria monocytogenes de tipo salvaje.

En una realización muy especialmente preferida de la presente invención la secuencia IAC artificial es la secuencia de 1 pb según la SEC ID N.°: 1

-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC GTA TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCG CTA TGA AGA GAT ACG CGG TGG AAC CTG GAA CCT GAT GGC ATC AAG ATT ACA C-3'.

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1. Una bacteria genéticamente modificada de la especie Listeria monocytogenes, en la que se ha delecionado el locus genómico del factor de transcripción PrfA, caracterizada porque a nivel genómico contiene una secuencia artificial que actúa como control interno de amplificación (IAC).

2. La bacteria Listeria monocytogenes de la reivindicación 1, en la que la secuencia artificial que actúa como IAC contiene las secuencias de unión al cebador en los extremos 5' y 3'.

3. La bacteria Listeria monocytogenes de la reivindicación 2, en la que las secuencias de unión al cebador son idénticas a las secuencias de unión al cebador del locus prfA de Listeria monocytogenes de tipo salvaje.

4. Una bacteria Listeria monocytogenes de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la secuencia artificial que actúa como IAC es una secuencia de 1 pb según la SEC ID N.° 1.

5. Una cepa Listeria monocytogenes EGDe de cualquier de las reivindicaciones 1 a 4 genéticamente modificada.

6. Una cepa Listeria monocytogenes EGDe genéticamente modificada según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, en la que se ha delecionado el locus genómico del factor de transcripción PrfA, que contiene la secuencia de control interno de amplificación (IAC) de SEC ID N.° 1 depositada en el DSMZ como Listeria monocytogenes AprfA/IAC+ con el número de identificación DSM 23639 el 2 de mayo de 21.

7. Uso de Listeria monocytogenes genéticamente modificada como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la detección y determinación cualitativa y/o cuantitativa de la presencia de Listeria monocytogenes de tipo salvaje en una muestra que se sospecha está contaminada con dicho microorganismo.

8. Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque la muestra es un alimento.

9. Uso de Listeria monocytogenes genéticamente modificada como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 como control interno del proceso de la muestra (CIPM) para un ensayo basado en PCR en tiempo real.

1. Un método para la detección y determinación de la presencia de Listeria monocytogenes de tipo salvaje en una muestra que se sospecha está contaminada con dicho microorganismo patógeno, que comprende los siguientes pasos:

(a) añadir a dicha muestra una cantidad predefinida de células de la bacteria Listeria monocytogenes genéticamente modificada como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

(b) incubar la muestra con una solución de extracción,

(c) aislar el ADN mediante métodos convencionales;

(d) aplicar la PCR en tiempo real, usando para ello (i) cebadores específicos para el locus prfA genómico de Listeria monocytogenes de tipo salvaje y la secuencia IAC de Listeria monocytogenes genéticamente modificada como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y (ii) una sonda oligonucleotídica marcada con fluorescencia que es capaz de hibridar específicamente con dicho locus prfA y una sonda oligonucleotídica marcada con fluorescencia que es capaz de hibridar específicamente con dicha secuencia IAC,

(e) determinar cualitativa y/o cuantitativamente las señales fluorescentes generadas en el paso (d), y

(f) determinar y/o calcular a partir del paso (e) la presencia y/o la cantidad de células de Listeria monocytogenes de tipo salvaje en la muestra original que se sospecha está contaminada con dicho microorganismo.

11. El método según la reivindicación 1, en el que los cebadores usados en el paso (d)(¡) son Lip1 (SEC ID N.° 2) y Lip2 (SEC ID N.° 3).

12. El método de la reivindicación 1 u 11, en el que las sondas marcadas con fluorescencia usadas en el paso (d)(¡¡) son pLucLm4 (SEC ID N.° 4) para la detección de la secuencia IAC y LlpProbe (SEC ID N.° 5) para la detección del locus prfA.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la solución de extracción del paso (b) contiene al menos MgChy/o un líquido Iónico.

14. Un kit para su uso en un ensayo para la detección y determinación de Listeria monocytogenes de tipo salvaje en una muestra que se sospecha está contaminada con dicho microorganismo, que comprende al menos en uno o más envases

(i) Listeria monocytogenes genéticamente modificada como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1

a 6;

(ii) los cebadores específicos del locus prfA genómico de Listeria monocytogenes de tipo salvaje y la secuencia IAC de Listeria monocytogenes genéticamente modificada según se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

(iii) una sonda oligonucleotídica marcada con fluorescencia que es capaz de hibridar específicamente con dicho locus prfA y una sonda oligonucleotídica marcada con fluorescencia que es capaz de hibridar específicamente con dicha secuencia IAC.

15. El kit según la reivindicación 14, en el que los cebadores son Lip1 (SEC. ID N.° 2) y Llp2 (SEC ID N.° 3).

16. El kit según la reivindicación 14 o 15, en el que las sondas marcadas con fluorescencia son pLucLm4 (SEC ID N.° 4) para la detección de la secuencia IAC y LipProbe (SEC ID N.° 5) para la detección del locus prfA.

17. Un método para la producción de una bacteria de la especie Listeria monocytogenes genéticamente modificada como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende los siguientes pasos:

(a) delecionar el locus genómico del factor de transcripción PrfA de la especie bacteriana Listeria monocytogenes,

(b) clonar un vector que contiene un IAC,

(c) transformar el vector del paso (b) en la especie bacteriana del paso (a).