Aptámero para NGF y uso del mismo.

Un aptámero que se une a NGF e inhibe la unión de NGF a un receptor de NGF,

que comprende una secuencia

UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91),

UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92),

UGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 93),

UGAAACAAACC (SEQ ID NO: 94),

UGAAAAGAACC (SEQ ID NO: 95),

UGAAAAAACCC (SEQ ID NO: 96),

UGAAAAAACCU (SEQ ID NO: 97),

UGAAAACAACC (SEQ ID NO: 98),

UGAAAUAAACC (SEQ ID NO: 99),

UGAAAUAAACU (SEQ ID NO: 100),

UGAAAAAAUCU (SEQ ID NO: 101),

AGAAUGAAACU (SEQ ID NO: 102),

CGAACAAAACU (SEQ ID NO: 103),

CGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 104),

UGAAAGGAACC (SEQ ID NO: 105),

UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110),

UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111),

CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112), o

CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113);

en donde Y es un nucleótido de pirimidina, y al menos un nucleótido está modificado.

Aptámero para NGF y uso del mismo Campo técnico

La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones, específicamente a un aptámero para NGF como el que se define en las reivindicaciones.

Técnica anterior

El factor de crecimiento nervioso (NGF) es la cebadora neurotrofina identificada en 1951, y es una importante proteína secretora implicada en el desarrollo y la supervivencia de neuronas periféricas y centrales. Consiste en 118 aminoácidos, tiene un peso molecular de 13 kDa, y tiene enlaces S-S en 3 posiciones en una molécula. BDNF, NT-3 y NT-4/5 están presentes en las proteínas de la familia, que están estructuralmente bien conservadas y forman un homodímero por medio de un enlace no covalente. Tiene una estructura en lámina [3 orientada en tres direcciones diferentes, y se considera que está dimerizada en esta parte. También tiene cuatro estructuras en bucle con una baja homología entre las familias, y se considera que estas partes definen la especificidad por los receptores.

En cuanto a los receptores de NGF, se conocen el receptor de tipo tirosina-quinasa TrkA con una elevada afinidad y p75 con una baja afinidad que pertenece a un superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral. Estos receptores actúan como un homodímero o un heterodímero y están profundamente implicados en el desarrollo y mantenimiento del sistema nervioso central. TrkA es un receptor transmembrana de un solo paso y tiene una estructura de tlroslna qulnasa en el dominio ¡ntracelular. Cuando NGF se une, se produce la fosforilación de la tlroslna, se transmite la señal aguas abajo, y se producen la promoción de la diferenciación y el mantenimiento de la supervivencia de la célula.

En cuanto a los receptores de la familia se conocen TrkA, TrkB y TrkC. TrkB se une a BDNF y NT-4/5, y TrkC se une a NT-3. p75 muestra una especificidad de ligando inferior en comparación con TrkA y también se une a BDNF, NT-3 y NT-4/5 además de a NGF. SI bien p75 es un receptor transmembrana de un solo paso, no tiene un dominio tirosina qulnasa en el lado cltoplásmlco. Como TrkA, se expresa no solamente en las células nerviosas sino también en las células no nerviosas. Se sabe que este receptor está implicado en la promoción de la diferenciación y el mantenimiento de la supervivencia de la célula, así como que está relacionado con la inducción de la apoptosis y la migración celular. Los resultados del análisis de la estructura cristalina han sugerido que un homodímero de NGF se une a TrkA a 2:2 y a p75 a 2:1. Aveces un homodímero de NGF se une a un heterodímero de TrkA y p75.

El NGF es producido por las células de Schwann, las células queratinizadas, las células epiteliales bronquiales, los fibroblastos, los linfocitos T, los macrófagos, los mastocitos, los linfocitos B, los queratinocitos, las células de la musculatura lisa, las células glomerulares renales, las células del músculo esquelético y similares. Por otra parte, se sabe que TrkA es expresado en células nerviosas, así como en monocitos, linfocitos T, linfocitos B y mastocitos distintos de las células nerviosas. De un modo similar, p75 es expresado en células nerviosas así como en células no nerviosas.

Es bien sabido que el NGF juega un papel clave en el sistema nervioso. Se ha aclarado que el NGF tiene una acción de mantenimiento de la supervivencia de las neuronas colinérgicas y se considera que está relacionado de alguna manera con la enfermedad de Alzheimer. Además, puesto que la administración intracerebral de NGF mejora los trastornos de la memoria de ratas de edad avanzada, también se espera que sea un fármaco terapéutico para la demencia senil.

Se ha descubierto que el NGF también actúa sobre los tejidos y las células distintos del sistema nervioso, y está implicado en la defensa del organismo y en el proceso de reparación tisular. Por ejemplo, se sabe que la administración de NGF a un animal incrementa la permeabilidad de los vasos sanguíneos, potencia las respuestas inmunitarias de las células T y las células B, induce la diferenciación de linfocitos, induce el crecimiento de los mastocitos, induce la liberación de diversas citoquinas desde los mastocitos y similares.

El NGF está relacionado con la infamación, y se ha observado un incremento de la expresión de NGF en pacientes con enfermedades inflamatorias y en modelos inflamatorios en animales. Son ejemplos de las mismas el lupus eritematoso generalizado, esclerosis múltiple, psoriasis, artritis, cistitis intersticial, asma y similares. Se ha informado de que el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide muestra una mayor concentración de NGF. Además, se ha informado sobre el aumento de expresión de NGF en ratas modelo de artritis reumatoide, y sobre un incremento en los mastocitos y un incremento en la expresión de NGF en ratón modelo de artritis.

El NGF está profundamente implicado en el dolor. Cuando el NGF se administra subcutáneamente a seres humanos, se producen un dolor profundo tal como dolor muscular continuo durante varios días, e hiperalgesia del lugar de la inyección. Los ratones con el gen de NGF desactivado y los ratones con el gen de TrkA desactivado carecen de nervios desmielinizados y no sienten dolor. Cuando el NGF se administra intraperitonealmente a 1 mg/kg a una rata madura, se produce hiperalgesia frente a estímulos de calor nocivo y mecánicos. El ratón transgénico para NGF muestra hiperalgesia que no está acompañada de afecciones inflamatorias. Además, se sabe que el gen

de TrkA de pacientes con insensibilidad congènita al dolor con anhìdrosìs (CIPA) tiene anomalías, y la sensación de dolor disminuye cuando el gen de NGF tiene anomalías.

A partir de lo anterior, se puede utilizar un Inhibidor de NGF corno fàrmaco terapèutico para el dolor tal como el dolor nociceptivo, el dolor Inflamatorio, el dolor neuropàtico, el dolor carcinomatoso, el dolor por fibromialgia y similares. Se ha informado sobre una terapia combinada de anticuerpo contra NGF y AINE (Documento WO04/073653), una terapia combinada de anticuerpo contra NGF y analgèsico opioide (Documento W004/096122), un mètodo de tratamiento del dolor post-quirùrgico utilizando un anticuerpo contra NGF (Documentos W004/032870, W005/000194), un método de tratamiento del dolor de cáncer de hueso utilizando un anticuerpo contra NGF (Documento WO05/111077), y un método de tratamiento del dolor de la osteoartrltls utilizando un anticuerpo contra NGF (Documento WO06/110883).

El Tanezumab (PF-4383119 o RN624) es un anticuerpo contra NGF, muestra efecto en el experimento de modelo de dolor utilizando un modelo animal de osteoartritis, y está actualmente en ensayo clínico. SI bien la presencia o ausencia de actividad inhibidora de NGF y receptor de NGF es desconocida, existe un informe referente al ARN natural que se une a NGF (documento no de patente 1 ).

En los últimos años, han llamado la atención las aplicaciones de los aptámeros de ARN para medicamentos, agentes de diagnóstico, y fármacos de ensayo; algunos aptámeros de ARN ya han estado en fase de estudio clínico o en uso práctico. En Diciembre de 2004, el cebador fármaco de aptámero de ARN del mundo, Macugen, fue aprobado como fármaco terapéutico para la degeneración macular relacionada con la edad en los Estados Unidos. Un aptámero de ARN hace referencia a un ARN que se une específicamente a una molécula diana tal como una proteina, y se puede preparar utilizando el método SELEX (Evolución Sistemática de Ligandos mediante Enriquecimiento Exponencial) (Referencias de Patente 1 - 3). En el método SELEX, se selecciona un ARN que se une específicamente a una molécula diana de una reserva de ARN con aproximadamente 1t/"* secuencias de nucleótldos diferentes. La estructura de ARN utilizada tiene una secuencia al azar de aproximadamente 40 residuos, que está flanqueada por secuencias de cebadores. Se permite que esta reserva de ARN se ensamble con una sustancia diana, y solamente el ARN que se ha unido a la sustancia diana se recoge utilizando un filtro y similares. El ARN recogido se amplifica mediante RT-PCR, y esto se utiliza como molde para la siguiente ronda. Repitiendo esta operación aproximadamente 10 veces, se puede obtener aptámero de ARN que se une específicamente a la sustancia diana.

Los fármacos de aptámeros, como los fármacos de anticuerpos, se pueden dirigir a factores extracelulares. Con referencia a muchas publicaciones científicas y otros materiales de referencia de dominio público, se considera que los fármacos de aptámeros superan potenclalmente a los fármacos de anticuerpos en ciertos aspectos. Por ejemplo, los aptámeros a menudo muestran una fuerza de unión superior y una especificidad superior... [Seguir leyendo]

1. Un aptámero que se une a NGF e inhibe la unión de NGF a un receptor de NGF, que comprende una secuencia UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91),

UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92),

UGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 93),

UGAAACAAACC (SEQ ID NO: 94),

UGAAAAGAACC (SEQ ID NO: 95),

UGAAAAAACCC (SEQ ID NO: 96),

UGAAAAAACCU (SEQ ID NO: 97),

UGAAAACAACC (SEQ ID NO: 98),

UGAAAUAAACC (SEQ ID NO: 99),

UGAAAUAAACU (SEQ ID NO: 100),

UGAAAAAAUCU (SEQ ID NO: 101),

AGAAUGAAACU (SEQ ID NO: 102),

CGAACAAAACU (SEQ ID NO: 103),

CGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 104),

UGAAAGGAACC (SEQ ID NO: 105),

UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110),

UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111),

CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112), o CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113);

en donde Y es un nucleótido de pirimidina, y al menos un nucleótido está modificado.

2. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia mostrada por UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110), UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111), CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112), CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113) o AGAAUGAAACU (SEQ ID NO: 102), en donde Y es un nucleótido de pirimidina y al menos un nucleótido de la secuencia anteriormente mencionada está modificado.

3. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia mostrada por UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91), UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92),

UGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 93), CGAACAAAACU (SEQ ID NO: 103),

CGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 104) o AGAAUGAAACU (SEQ ID NO: 102),

en donde al menos un nucleótido de la secuencia anteriormente mencionada está modificado.

4. El aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la longitud del aptámero es de 100 bases o menos.

5. El aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la longitud del aptámero es de 60 bases o menos.

6. El aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los grupos hidroxilo de la posición 2' de una rlbosa de los respectivos nucleótidos de pirimidina son ¡guales o diferentes y están remplazados o no están remplazados por un átomo o grupo seleccionados del grupo que consiste en un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, y un grupo metoxi.

7. El aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde los grupos hidroxilo de la posición 2' de una ribosa de los respectivos nucleótidos de purina son ¡guales o diferentes y están remplazados o no

están remplazados por un átomo o grupo seleccionado del grupo que consiste en un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor y un grupo metoxl.

8. El aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que Inhibe la actividad de crecimiento de neuritas del NGF.

5 9. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 8, que tiene una concentración Inhibidora del 50% (CI50) de no más

de 100 nM, preferiblemente no más de 10 nM, para la Inhibición de una actividad de crecimiento de neuritas del NGF.

10. Un medicamento que comprende el aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. El aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en la prevención y/o el 10 tratamiento del dolor.

12. El aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades Inflamatorias.