Anticuerpos dirigidos contra el complejo E1E2 del virus de la hepatitis C y sus epítopos.

Utilización de un péptido que comprende una secuencia definida por SEC ID nº 1,

SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, para detectar en el suero de un paciente infectado por VHC la presencia de anticuerpos específicos que pueden reaccionar simultáneamente con las tres regiones de E1 y E2 reconocidas por el anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma depositado en la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, París, Francia) el 19 de marzo de 2003, bajo el número de acceso CNCM 1-2983, en el que dichas tres regiones de E1 y E2 están constituidas por cada una de las secuencias siguientes:

- los aminoácidos 297 a 306 de la proteína E1 del VHC (SEC ID nº 1);

- los aminoácidos 480 a 494 de la proteína E2 del VHC (SEC ID nº 2); y

- los aminoácidos 613 a 621 de la proteína E2 del VHC (SEC ID nº 3).

Anticuerpos dirigidos contra el complejo E1E2 del virus de la hepatitis C y sus epítopos.

Sector de ¡a técnica

La presente invención se refiere al uso de péptidos que reconocen anticuerpos conformaclonales dirigidos contra el VHC y más particularmente a anticuerpos monoclonales. La Invención también se refiere al uso de tales péptidos para detectar tales anticuerpos en el suero de pacientes infectados por VHC.

Estado de ia técnica

La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) es una causa principal de hepatitis crónica y cirrosis y puede conducir al carcinoma hepatocelular. Con aproximadamente 200 millones de personas en todo el mundo afectadas crónicamente por VHC, esta enfermedad ha emergido como un problema sanitario grave a escala global. El VHC es un virus ARN con cubierta que pertenece al género /-/epac/v/rus de la familia F/av/r/dae. Su genoma es un ARN monocatenario de 9,6 kb de polaridad positiva con una reglón 5' no traducida (UTR) que funciona como sitio interno de entrada ribosómica, un único marco de lectura abierta codificante de una poliproteína de aproximadamente 3.000 aminoácidos y una 3'UTR (Bartenschlager ef a/., 2000). Esta poliproteína es cortada durante o después de la traducción por las peptidasas de la célula huésped, proporcionando proteínas estructurales, entre ellas la proteína nuclear y las glucoproteínas de cubierta E1 y E2, y por las proteasas víricas, generando las proteínas no estructurales (NS) 2 a 5B (Bartenschlager ef a/., 2000). Análogamente a los virus ARN de cadena positiva relacionados, la replicación se produce pasando por un ARN Intermediario de cadena negativa y resulta catalizada por las proteínas NS, que forman un complejo de repllcasa asociado a la membrana citoplasmática.

Los bajos niveles de partículas de VHC presentes en las muestras de plasma de pacientes y la falta de un sistema de cultivo celular que proporcione soporte a una replicación del VHC o un ensamblaje de las partículas eficientes han dificultado la caracterización de las glucoproteínas asociadas al virión. Los conocimientos actuales sobre las glucoproteínas de cubierta del VHC se basan en ensayos de cultivo celular de la expresión transitoria con vectores de expresión víricos o no víricos. Estos estudios han demostrado que las glucoproteínas E1 y E2 interactúan formando complejos (revisado en Dubuisson, 2000). En presencia de detergentes no iónicos, se detectan dos formas de complejos E1E2: un heterodímero E1E2 estabilizado mediante Interacciones no covalentes y los agregados heterogéneos unidos por enlaces disulfuro, que se considera que representan complejos incorrectamente plegados. Anteriormente, se han obtenido anticuerpos específicos de glucoproteínas de cubierta mediante inmunización con péptidos sintéticos o con antígenos recomblnantes. Un anticuerpo monoclonal (mAb) reactivo con E2 sensible a la conformación (H2) que reconoce los heterodímeros E1E2 unidos no covalentemente que se consideran la forma pregemación nativa del heterodímero de glucoproteína del VHC, sin embargo, no reaccionan con las partículas derivadas de suero positivas para ARN de VHC (Deleersnyder ef a/., 1997). Además, el documento WO 92/07001 da a conocer anticuerpos que se han preparado mediante Inmunización de ratones utilizando una preparación de partículas de VHC extraídas de chimpancés Infectados; sin embargo, estos anticuerpos no han sido sometidos a ensayo con partículas de VHC naturales (es decir, derivadas de pacientes Infectados). Además, el documento WO 00/05266 da a conocer anticuerpos preparados a partir de células B de pacientes infectadas; sin embargo, estos anticuerpos se han seleccionado según su capacidad para unirse a la proteína E2 recombinante. Por lo tanto, todos estos anticuerpos resultan de utilidad limitada para fines diagnósticos o para fines terapéuticos o profilácticos debido a que se han producido o seleccionado utilizando VHC no naturales, o partes de los mismos, y no se ha demostrado que ¡nteractúen con partículas de VHC naturales.

La falta de preparaciones de VHC que contengan partículas naturales de VHC con cubierta en cantidad y concentración suficientes es uno de los motivos de que no hayan podido obtenerse hasta ahora anticuerpos que puedan reconocer las partículas de VHC naturales. De hecho, los bajos niveles de partículas de VHC en las muestras de plasma han dificultado la caracterización y observación de este virus. Anteriormente se ha demostrado que los virus recuperados durante la etapa aguda de la infección a partir del plasma de pacientes naturalmente Infectados presenta una densidad de flotación de aproximadamente 1,06 g/ml en sacarosa (Hljlkata ef a/., 1993). En contraste, los VHC recuperados de cultivos celulares tras la replicación /n v/fro presenta una densidad de flotación de 1,12 g/ml en sacarosa (Yoshikura ef a/., 1996). Finalmente, los VHC recuperados de Individuos Infectados crónicamente presenta una densidad de flotación de aproximadamente 1,17 g/ml en sacarosa (Hljlkata ef a/., 1993). La baja densidad del virus derivado de suero se ha atribuido a su asociación con llpoproteínas de baja densidad séricas (Thomssen ef a/., 1992). El virus de alta densidad se ha demostrado que se asocia a anticuerpos unidos al virus en complejos de antígeno-anticuerpo (Kanto ef a/., 1995). A pesar de estos datos, todavía no se dispone de datos sobre la composición de las proteínas de estas diferentes poblaciones de VHC, ni se conoce si las fracciones de baja densidad (<1,0 g/ml) contienen cubierta, ARN y nucleocápside en forma de vlrlones completos.

Por lo tanto, un objetivo de la invención consiste en proporcionar el uso de péptidos que reconocen anticuerpos que reaccionen con las partículas de VHC naturales.

El documento WO 96/04385 da a conocer tres péptidos sintéticos, que corresponden respectivamente a los

aminoácidos 289-308 de la proteína E1 del VHC, a los aminoácidos 475-494 de la proteína E2 del VHC y a los aminoácidos 619-638 de la proteína E2 del VHC.

Otro aspecto de la invención describe composiciones de partículas naturales del VHC, en cantidad y concentración suficientes para permitir la inmunización eficiente de los animales productores de anticuerpos.

Otro aspecto de la invención describe composiciones de VHC específicas sin infectividad que puedan utilizarse como sustancias activas en composiciones farmacéuticas.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere al uso de péptidos que reconocen un anticuerpo conformacional que puede unirse específicamente a la cubierta vírica del VHC natural.

La expresión "anticuerpo conformacional" se refiere a un anticuerpo que reconoce un epítopo que presenta una estructura tridimensional definida por su entorno molecular

La expresión "de unión específica" se refiere a que el anticuerpo se une a un epítopo que se encuentra en sustancialmente sólo uno de los elementos que forman la cubierta vírica del VHC natural, es decir, que no se produce sustancialmente ninguna unión del anticuerpo a elementos diferentes a los que forman la cubierta del VHC natural. Por ejemplo, la especificidad de unión del anticuerpo puede someterse a ensayo mediante métodos bien conocidos por el experto en la materia, tales como experimentos de transferencia western, en los que se hacen migrar electroforéticamente muestras biológicas dentro de un gel, que después se transfieren a una membrana y se coincuban con dicho anticuerpo, realizando seguidamente la detección utilizando un anticuerpo secundario. Se dice que dicho anticuerpo es "de unión específica" a un compuesto diana contenido en dichas muestras biológicas en el caso de que sustancialmente la totalidad de las bandas electroforéticas detectadas contengan el compuesto diana o partes del mismo.

El acrónimo "VHC" se refiere a "virus de la hepatitis C"; se describe en particular en Choo ef a/. (1989, 1991). El VHC particularmente comprende ARN, una cápside formada de una proteína nuclear, y una cubierta que comprende lípidos y proteínas, particularmente glucoproteínas.

La "cubierta vírica del VHC" está formada de lípidos y proteínas, en particular glucoproteínas, tales como las proteínas E1 y E2 del VHC (Clarke, 1997).

El término "natural" se refiere al VHC, o partes del mismo, tal como se encuentra en muestras biológicas y posiblemente en su forma aislada y, en caso necesario, en su forma purificada a partir de muestras biológicas. Dichas muestras pueden ser de sangre, plasma o suero procedentes de pacientes infectados por VHC. En particular, el término "natural" se refiere al VHC, o partes del mismo, que no ha sido producido mediante métodos recombinantes o mediante la utilización de líneas celulares o animales,... [Seguir leyendo]

Utilización de un péptido que comprende una secuencia definida por SEC ID n° 1, SEC ID n° 2 o SEC ID n° 3, para detectar en el suero de un paciente Infectado por VHC la presencia de anticuerpos específicos que pueden reaccionar simultáneamente con las tres regiones de E1 y E2 reconocidas por el anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma depositado en la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Instituí Pasteur, París, Francia) el 19 de marzo de 2003, bajo el número de acceso CNCM 1-2983, en el que dichas tres regiones de E1 y E2 están constituidas por cada una de las secuencias siguientes:

los aminoácidos 297 a 306 de la proteína E1 del VHC (SEC ID n° 1);

los aminoácidos 480 a 494 de la proteína E2 del VHC (SEC ID n° 2); y

los aminoácidos 613 a 621 de la proteína E2 del VHC (SEC ID n° 3).

Utilización según la reivindicación 1, en la que el péptido está biotilinado.

Método para detectar en el suero obtenido de un paciente infectado por VHC la presencia de anticuerpos específicos que pueden reaccionar simultáneamente con las tres reglones de E1 y E2 reconocidas por el anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma depositado en la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Instituí Pasteur, París, Francia) el 19 de marzo de 2003, bajo el número de acceso CNCM 1-2983, en el que dichas tres regiones de E1 y E2 están constituidas por cada una de las secuencias siguientes:

los aminoácidos 297 a 306 de la proteína E1 del VHC (SEC ID n° 1);

los aminoácidos 480 a 494 de la proteína E2 del VHC (SEC ID n° 2); y

los aminoácidos 613 a 621 de la proteína E2 del VHC (SEC ID n° 3), comprendiendo el método las

etapas de:

poner en contacto dicho suero con un péptido que comprende una secuencia definida por SEC ID NO; 1, SEC ID n° 2 o SEC ID n° 3, para permitir la formación de un complejo entre dicho péptido y cualquier anticuerpo específico presente en el suero; y

detectar la presencia de cualquier complejo formado.

Método según la reivindicación 3, en el que la detección de la presencia de cualquier complejo formado comprende usar un anti-lgG humana de cabra conjugado con peroxidasa.

Método según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que el péptido está biotinilado y en el que antes de la etapa de puesta en contacto, el péptido se une a una superficie sólida recubierta con estreptavidina.