Ampliación del rango de medición de ensayos cromatográficos rápidos.

Método de determinación cuantitativa de un analito en una muestra,

que comprende

(a) preparación de una sustancia específica del analito que al entrar en contacto con él es capaz de reaccionar con el mismo produciendo una señal detectable, de manera que para proporcionar la sustancia específica del analito se usa una tira de ensayo;

(b) elaboración de, al menos, dos gráficos de calibración obtenidos respectivamente por reacción de la misma sustancia específica del analito con diferentes cantidades de un mismo analito, para unos tiempos de reacción prefijados respectivamente;

(c) puesta en contacto de la sustancia específica del analito con una muestra que contiene el analito buscado;

(d) medición de la señal correspondiente a un primer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un primer gráfico de calibración según (b);

(e) comprobación de que la señal medida en (d) permite una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado;

(f)

(i) determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (d) cuando se alcanza la exactitud deseada, de modo que para determinar cuantitativamente el analito, la señal medida según (d) se compara con el primer gráfico de calibración elaborado para el primer tiempo de reacción prefijado, o (ii) medición de la señal correspondiente a un segundo tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un segundo gráfico de calibración según (b);

(g) comprobación de que la señal medida en (f) (ii) permita una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado; y

(h)

(i) determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (f) (ii) cuando se alcanza la exactitud deseada, de modo que para determinar cuantitativamente el analito, la señal medida según (f) (ii) se compara con el segundo gráfico de calibración elaborado para el segundo tiempo de reacción prefijado, o (ii) continuación de la determinación para al menos otro tiempo de reacción prefijado correspondiente a (f) (ii), (g), (h) (i)

Ampliación del rango de medición de ensayos cromatográficos rápidos La presente invención se refiere a métodos y dispositivos de determinación cuantitativa de un analito en una muestra Un método de análisis ampliamente utilizado para la determinación rápida de analilos como por ejemplo drogas, honnonas del embarazo, enfermedades infecciosas o marcadores cardiacos recurre al empleo de tiras de ensayo inmunológicas. Para ello se usan en general ensayos tanto cualitativos (p.ej. CARDIAC O-Dimer, Trop T sensitive, etc.) como cuantitativos, que se valoran mediante un aparato lector (p.ej. Elecsys® proBNP, Rache CARDIAC proBNP, etc.) .

Estas tiras de ensayo inmunológicas para detenninación cuantitativa se caracterizan sobre todo por su facilidad de manejo. El fundamento general de las tiras de ensayo es la reacción del reactivo contenido en ellas con un analito de la muestra y la consiguiente producción de una señal detectable, que suele medirse por remisión al cabo de un tiempo prefijado. El lapso de tiempo transcurrido entre la puesta en contacto del anal ita con el reactivo y la medición de la señal se elige lo más largo posible. De esta manera se asegura un largo tiempo de reacción entre el reactivo y el analito y por lo tanto que estas tiras tenga la mayor sensibilidad posible. Sin embargo, debido a la cinética de las reacciones, tras un tiempo de reacción tan largo ya no es posible determinar cuantitativamente analitos presentes en la muestra a una concentración elevada Por eso, en comparación con sistemas analiticos de laboratorio corrientes, como p.ej. Elecsys (Roche Diagnostics) , 1M (Abbott) , Dimension (Dade Behring) , estas tiras de ensayo aún tienen claramente puntos débiles en cuanto a eficiencia. En concreto la exactitud de la medición y su rango dinámico son mucho peores en las tiras de ensayo, por ejemplo en comparación con las reacciones en solución. Esto limita su uso para la determinación de analitos que requieren una gran sensibilidad y también un rango de medición lo más amplio posible. Sobre todo, en caso de asistencia médica de urgencia a pacientes seria de mucha ayuda para el médico tratante disponer de un ensayo o de un método de gran sensibilidad que por una parte permitiera descartar con seguridad ciertas enfermedades y por otra parte ofreciera un amplio rango de medición. En particular, para la estratificación de riesgos y para el control

terapéutico es deseable que el rango de medición de un analito sea amplio. La ampliación del rango de medición de los ensayos es especialmente importante para aquellos estados patológicos en que la concentración de un analito o marcador caracteristico del estado tiene relación con la gravedad del estado patológico. En tales casos una mayor concentración de marcador (p.ej. NT-proBNP) puede ser indicio de una grave situación de peligro para el paciente.

Por tanto uno de los objetos de la presente invención era proporcionar un método para ampliar el rango de medición cuantitativa de un analito en una muestra.

Este objetivo se resuelve mediante la determinación cuantitativa de un analito en una muestra, incluyendo

(a) preparación de una sustancia especifica del analito que al entrar en contacto con él es capaz de reaccionar con el mismo produciendo una señal detectable, de manera que para proporcionar la sustancia especifica del analito se usa una tira de ensayo;

(b) elaboración de, al menos, dos gráficos de calibración obtenidos respectivamente por reacción de la misma sustancia especifica del analito con diferentes cantidades de un mismo analito, para unos tiempos de reacción prefijados respectivamente;

(c) puesta en contacto de la sustancia especifica del analito con una muestra que contiene el analito buscado;

(d) medición de la señal correspondiente a un primer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un primer gráfico de calibración según (b) ;

(e) comprobación de que la señal medida en (d) permite una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado;

(1)

(i) determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (d) cuando se alcanza la exactitud deseada, o

(ii) medición de la señal correspondiente a un segunda tiempo de reacción prefijada, para el cual existe un segundo grafico de calibración según (b) ;

(g) comprobación de que la señal medida en (f) (ii) permita una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el grafico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado; y

(h)

(i) determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (f) (ii) cuando se alcanza la exactitud deseada, o

(ii) continuación de la determinación para al menos otro tiempo de reacción prefijado correspondiente a (f) (ii) , (9 ) , (h) (i) ,

es decir, dado el caso,

(i) medición de la señal correspondiente a un tercer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un tercer gráfico de calibración según (b) ;

(j) comprobación de que la señal medida en (i) permite una determinación cuantitativa del analito con una

exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado; Y

<kl

(i) determinación cuantitativa del anal ita basada en la señal medida en (i) cuando se alcanza la exactitud 10 deseada, o (ii) continuación de la determinación para al menos otro tiempo de reacción prefijado Los pasos (f) (ji) , (g) y (h) (i) del método se pueden repetir tantas veces como se quiera. En una forma de ejecución preferida se repiten dos o tres veces, es decir, se elaboran o establecen respectivamente dos o tres gráficos de 15 calibración para dos o tres tiempos de reacción prefijados.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de determinación cuantitativa de un analito en una muestra, que comprende (a) preparación de una sustancia especifica del analito que al entrar en contacto con él es capaz de reaccionar

con el mismo produciendo una señal detectable, de manera que para proporcionar la sustancia especifica del analito se usa una tira de ensayo;

(b) elaboración de, al menos, dos gráficos de calibración obtenidos respectivamente por reacción de la misma sustancia específica del analito con diferentes cantidades de un mismo analito, para unos tiempos de reacción prefijados respectivamente;

(c) puesta en contacto de la sustancia específica del analito con una muestra que contiene el analito buscado;

(d) medición de una primera señal correspondiente a un primer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un primer grafico de calibración según (b) ;

(e) medición de una segunda señal correspondiente a un segundo tiempo de reacción prefijado, para el cual

existe un segundo grafico de calibración según (b) ; 30 (f) medición opcional de otra señal;

(g) comprobación de cuál de las señales medidas según (d) , (e ) o (f) permite determinar cuantitativamente el analito con suficiente exactitud, de modo que la exactitud deseada para el anal ita buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado, y

(h) determinación cuantitativa del analito basada en la señal que permite una exactitud suficiente.

En una forma de ejecución preferida, para comprobar si la primera o la segunda señal medida permite determinar cuantitativamente el analito con una mayor exactitud, se establece un valor limite de concentración empírico basado como mínimo en los dos gráficos de cal ibración elaborados. Las concentraciones de analito superiores a este valor

limite se evalúan según el tiempo de reacción mas corto de ambos, mientras que las concentraciones de analito inferiores a este valor límite se evalúan según el tiempo de reacción mas largo de ambos. Si se comprueba que la concentración de analito supera el valor límite tras el tiempo de reacción más corto, es decir, si se determina una elevada concentración de analito, el proceso se puede finalizar en este momento.... [Seguir leyendo]

Método de determinación cuantitativa de un analito en una muestra, que comprende

(a) preparación de una sustancia específica del analito que al entrar en contacto con él es capaz de reaccionar con el mismo produciendo una señal detectable, de manera que para proporcionar la sustancia especifica del analito se usa una tira de ensayo;

(b) elaboración de, al menos, dos gráficos de calibración obtenidos respectivamente por reacción de la misma sustancia especifica del analito con diferentes cantidades de un mismo analito, para unos tiempos de reacción prefijados respectivamente;

(c) puesta en contacto de la sustancia especifica del analito con una muestra que contiene el anal ita buscado;

(d) medición de la señal correspondiente a un primer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un primer gráfico de calibración según (b) ;

(e) comprobación de que la señal medida en (d) permite una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado;

(~

(i) determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (d) cuando se alcanza la exactitud deseada, de modo que para determinar cuantitativamente el analito, la señal medida según (d) se compara con el primer gráfico de calibración elaborado para el primer tiempo de reacción prefijado, o

(ii) medición de la señal correspondiente a un segundo tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un segundo gráfico de calibración según (b) ;

(g) comprobación de que la señal medida en (f) (ii) permita una determinación cuantitativa del analito con una exactitud deseada, que para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado; y

(h)

(i) determinación cuantitativa del analito basada en la señal medida en (f) (ii) cuando se alcanza la exactitud deseada, de modo que para determinar cuantitativamente el analito, la señal medida según (f) (ii) se compara con el segundo grafico de calibración elaborado para el segundo tiempo de reacción prefijado, o

(ii) continuación de la determinación para al menos otro tiempo de reacción prefijado correspondiente a (f) (ii) , (g) , (h)

(i)

2. Método de determinación cuantitativa de un analito en una muestra, que comprende

(a) preparación de una sustancia específica del analito que al entrar en contacto con él es capaz de reaccionar con el mismo produciendo una señal detectable, de manera que para proporcionar la sustancia especifica del analito se usa una tira de ensayo;

(b) elaboración de, al menos, dos gráficos de calibración obtenidos respectivamente por reacción de la misma sustancia especifica del analito con diferentes cantidades de un mismo analito, para unos tiempos de reacción prefijados respectivamente;

(c) puesta en contacto de la sustancia especifica del analito con una muestra que contiene el anal ita buscado;

(d) medición de una primera señal correspondiente a un primer tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un primer gráfico de calibración según (b) ;

(e) medición de una segunda señal correspondiente a un segundo tiempo de reacción prefijado, para el cual existe un segundo gráfico de calibración según (b) ;

(f) medición opcional de otra señal;

(g) comprobación de cuál de las señales medidas según (d) , (e) o (f) permite determinar cuantitativamente el analito con suficiente exactitud, de modo que la exactitud deseada para el analito buscado se logra cuando el gráfico de calibración considerado presenta la mayor pendiente de todas las curvas de calibración elaboradas respecto a la correspondiente cantidad del analito buscado, y

(h) determinación cuantitativa del analito basada en la señal que permite una exactitud suficiente, de modo que para determinar cuantitativamente el analito se compara esta señal con el gráfico de calibración elaborado para el tiempo de reacción correspondiente a dicha señal.

Método según la reivindicaciÓn 1 o 2, caracterizado porque la exactitud de la determinación cuantitativa del analito se comprueba mediante la pendiente de los gráficos de calibración.

4. Método según la reivindicación 1 o 3, caracterizado porque el analito de ensayo y el analito objeto de la determinación cuantitativa son idénticos

5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se elaboran dos o tres gráficos de calibración

6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los limites del rango de medición del analito objeto de la determinación se amplían por un factor de 2 hasta 5, preferiblemente superior a tres.

Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se usa una muestra procedente de liquido corporal, preferiblemente una muestra de sangre, plasma, suero, saliva u orina 8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque simultáneamente con el analito objeto 5 de la determinación cuantitativa se determinan cualitativa yfo cuantitativamente otros analitos 9. Método según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el analito se elige entre ácidos nucleicos, lipidos, hidratos de carbono, proteinas, y en particular entre ADN, ARN, anticuerpos, antígenos, productos metabólicos, hormonas, Virus, microorganismos, células, marcadores cardioespecificos, marcadores neuro

hormonales, marcadores isquémicos y marcadores musculares especificos.

10. Método según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque al menos un marcador cardioespecífico se elige entre troponina r, mioglobina, dimero O y NT-proBNP.

11. Método según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la sustancia específica del analito se elige entre anticuerpos, receptores capaces de fijar el anal ita, antígenos, lectinas, ácidos nucleicos y análogos de ácidos nucleicos, de manera que la sustancia especifica del analito está preferiblemente acoplada a un reactivo de detección.

12. Método según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la reacción entre el analito y la sustancia especifica del analito es una reacción inmunológica 13. Método según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la determinación cuantitativa se efectúa por medios ópticos, en particular por detección renectofotométrica o nuorimétrica o por electroquimio25 luminiscencia.

Método según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque está automatizado