Almacenamiento a largo plazo de G-CSF humano recombinante no glicosilado.

Un método para el almacenamiento estable a largo plazo de G-CSF humano recombinante no glicosilado,

comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) proporcionar una composición acuosa de G-CSF tamponada con acetato o glutamato que contiene un GCSF humano recombinante no glicosilado y sorbitol, en donde la cantidad de G-CSF está en el intervalo de 0,1 mg/ml a 8,0 mg/ml y en donde dicha composición tiene un volumen de 100 ml a 8 I;

(b) enfriar la composición de G-CSF proporcionada en la etapa (a) hasta una temperatura de -15°C o menos para obtener una formulación de G-CSF congelada;

(c) almacenar la composición de G-CSF obtenida en la etapa (b) en estado congelado a lo largo de un período de al menos un mes; y

(d) incrementar la temperatura de la composición de G-CSF congelada de la etapa (c) hasta una temperatura dentro del intervalo de 2°C a 8°C a lo largo de un período de tiempo ajustado para permitir que la composición se descongele y para obtener una composición líquida que tenga un contenido de G-CSF de al menos 95% del contenido de G-CSF de la composición proporcionada en la etapa (a).

Almacenamiento a largo plazo de G-CSF humano recomblnante no gllcosllado

La presente Invención se refiere a un método para el almacenamiento a largo plazo de G-CSF humano recomblnante no gllcosllado.

El G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos, por sus siglas en inglés) es un factor de crecimiento natural que pertenece a la familia de las citocinas. El G-CSF representa un papel crucial en la hematopoyesis y mejora la maduración, la proliferación, la diferenciación y la supervivencia de los neutrófilos y las células sucesoras neutrofíllcas. Clínicamente, el G-CSF se usa principalmente para controlar tumores y, en particular, para el tratamiento de la neutropenia después de la quimioterapia, y también se aplica para trasplantes de médula ósea y en el tratamiento de enfermedades infecciosas.

El G-CSF humano en su forma natural es una glicoproteína de aproximadamente 2 kDa que tiene cinco residuos de cisterna. Cuatro de estos residuos forman dos puentes de disulfuro intramoleculares que son cruciales para la actividad de la proteína. Como el G-CSF se obtiene sólo en pequeñas cantidades de fuentes naturales, se usan principalmente formas recombinantes de G-CSF en los medicamentos, en particular los que se han producido expresando la proteína en huéspedes procarióticos. Las proteínas expresadas en huéspedes procarióticos tales como E. coli difieren del G-CSF natural en que no están glicosiladas. Las proteínas expresadas en E. coli tienen un residuo se metionina N-terminal adicional necesario para la expresión en este organismo huésped.

Debido a la alta hidrofobia de la proteína, el G-CSF recombinante no glicosilado es relativamente inestable. La molécula se adsorbe fácilmente a la superficie interna de los recipientes de almacenamiento, los viales, las jeringas o similares y forma dímeros y agregados superiores. Las formulaciones de G-CSF líquidas convencionales también son sensibles al estrés mecánico, por ejemplo como resultado de la agitación durante el transporte, y a la congelación y descongelación accidentales, que también pueden dar como resultado niveles superiores de agregados y una pérdida de actividad biológica. Por otra parte, el G-CSF está sometido a modificaciones químicas tales como desamidación, oxidación, escisión de puentes de disulfuro o proteolisis. La desamidación, que se produce más rápidamente que otras rutas de degradación, es un problema particular debido al alto contenido de glutamina del G-CSF. En conjunto, esto puede dar como resultado un contenido reducido de G-CSF monómero biológicamente disponible y activo, particularmente durante el almacenamiento prolongado de la proteína. Esto no sólo es costoso sino que también es indeseable por razones terapéuticas, por ejemplo si el G-CSF se va a administrar a lo largo de un período de tiempo prolongado con una dosificación constante. Por otra parte, los productos formados mediante multimerización o desamidación pueden dar como resultado una respuesta inmunitaria no deseada.

La estabilización de formulaciones de G-CSF es objeto de diversa bibliografía de patentes y no relacionada con las patentes.

El documento DE-A-37 23 7S1 describe formulaciones acuosas de G-CSF tamponadas con fosfato que contienen tensioactivos farmacéuticamente aceptables tales como ésteres de polioxietilensorbitán que se usan en combinación con albúmina de suero humano y manitol para estabilizar el ingrediente activo. Estas formulaciones son estables a 4°C a lo largo de un período de tiempo prolongado. Sin embargo, debido a sus propiedades antigénicas, las proteínas y los péptidos de origen humano y animal pueden provocar reacciones inmunológicas no deseadas.

El documento EP-A- 373 679 divulga formulaciones de G-CSF que tienen un valor del pH de 2,75 a 4, y baja conductividad, que se pueden almacenar a lo largo de períodos de tiempo prolongados sin formación de agregados. Si existe, el tampón se usa en estas formulaciones en cantidades pequeñas de menos de 2 mM a fin de evitar la agregación del G-CSF.

El documento EP-A-1 197 221 divulga formulaciones de G-CSF estables a largo plazo a un pH de 5 a 7, que contienen uno o más aminoácidos del grupo de lisina, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, treonina y asparagina, así como uno o más aminoácidos hidrófobos. La metionina se añade para prevenir la oxidación de los residuos de metionina de la molécula de G-CSF.

El documento WO-A-27/3459 divulga formulaciones acuosas estables que contienen G-CSF humano recombinante y un aminoácido que es un supresor de la oxidación para los residuos de metionina de la proteína.

El documento WO-A-25/4224 divulga composiciones farmacéuticas que comprenden G-CSF y un ácido tal como ácido acético o ácido glutámico, que está libre de tensioactivos.

El documento WO-A-25/3962 divulga composiciones tamponadas con succinato y tartrato estables a lo largo de un amplio intervalo de pH.

Hermán, A.C. et al. ("Characterisation, Formulation, and Stability of Neupogen® (Filgrastim), a Recombinant Human Granulocyte-Colony Stimulating Factor". En: Formulation Characterisation and Stability of Protein Drugs, pp. 33- 32S, R. Pearlman y Y.J. Wang, Eds., Plenum Press, Nueva York, 1996) describen composiciones estabilizadas de

G-CSF recombinante no glicosilado que contienen 1 mM de acetato sódico, pH 4,, 5% de manitol y ,4% de polisorbato 8. Tales composiciones son estables durante más de 24 meses a 2-8°C. Se encontró que sustituir el manitol por sorbitol en una formulación de filgrastim eliminaba la sensibilidad de la proteína a la agregación durante la congelación y la descongelación accidentales. Sin embargo, el almacenamiento en un congelador se debe evitar según las instrucciones del fabricante.

El documento WO-A-27/99145 divulga formulaciones líquidas de G-CSF tamponadas con acetato que comprenden polisorbato 2 y/o polisorbato 8 como un tensioactivo y que tienen un valor del pH entre 4,1 y 4,4

El documento WO-A-28/122415 divulga formulaciones líquidas acuosas de G-CSF tamponadas con glutamato que tienen un pH de 3,5 a 4,8 y que son estables bajo las condiciones de estrés mecánico encontradas, por ejemplo, al congelar y descongelar.

El documento WO-A-29/2776 divulga formulaciones de G-CSF tamponadas con acetato que comprenden un alcohol sacárico tal como sorbitol y un tensioactivo. La estabilidad al almacenamiento de estas formulaciones se prueba a 5°C y 4°C.

El documento US 6.956.23 B1 divulga un método para reducir la intolerancia alimentaria en un lactante administrando enteralmente G-CSF al lactante. La formulación acuosa de G-CSF descrita comprende filgrastim, cloruro sódico, acetato sódico, cloruro potásico y albúmina humana. El sorbitol se menciona como un excipiente opcional. La formulación líquida es estable cuando se almacena durante tres semanas a -8°C.

Piedmonte et al. (Pharmaceutical Research, Vol. 24, N° 1, enero de 27, pp: 136-146) describen el efecto del sorbitol sobre la agregación de proteínas en formulaciones de proteínas congeladas. Piedmonte y Treuheit (Advanced Drug Delivery Reviews 6, 28, 5-58) menciona la importancia del sorbitol y un pH adecuado para la estabilidad de formulaciones acuosas de pegfilgrastim.

El objetivo de la presente invención era proporcionar un método para el almacenamiento estable a largo plazo de G- CSF humano recombinante no glicosilado biológicamente activo, en donde se reduce la degradación, en particular la desamidación, y la pérdida de G-CSF durante el almacenamiento debido a fenómenos de adsorción a las paredes de los recipientes.

Este objetivo se consigue mediante el método de la presente invención para el almacenamiento estable a largo plazo de G-CSF humano recombinante no glicosilado, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) proporcionar una composición acuosa de G-CSF tamponada con acetato o glutamato que contiene un G- CSF humano recombinante no glicosilado y sorbitol, en donde la cantidad de G-CSF está en el intervalo de ,1 mg/ml a 8, mg/ml y en donde dicha composición tiene un volumen de 1 mi a 8 I;

(b) enfriar la composición de G-CSF proporcionada en la etapa (a) hasta una temperatura de -15°C o menos para obtener una composición de G-CSF congelada;

(c) almacenar la composición de G-CSF obtenida en la etapa (b) en estado congelado a lo largo de un período de al menos un mes; y

(d) incrementar la temperatura de la composición de G-CSF congelada de la etapa (c) hasta una temperatura dentro del intervalo de 2°C a 8°C a lo largo de un período de tiempo ajustado para permitir que la composición se descongele y para obtener una composición líquida que tenga un contenido de G-CSF de al menos 95%... [Seguir leyendo]

1. Un método para el almacenamiento estable a largo plazo de G-CSF humano recombinante no gllcosllado, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) proporcionar una composición acuosa de G-CSF tamponada con acetato o glutamato que contiene un G- CSF humano recomblnante no gllcosllado y sorbitol, en donde la cantidad de G-CSF está en el Intervalo de ,1 mg/ml a 8, mg/ml y en donde dicha composición tiene un volumen de 1 mi a 8 I;

(b) enfriar la composición de G-CSF proporcionada en la etapa (a) hasta una temperatura de -15°C o menos para obtener una formulación de G-CSF congelada;

(c) almacenar la composición de G-CSF obtenida en la etapa (b) en estado congelado a lo largo de un período de al menos un mes; y

(d) incrementar la temperatura de la composición de G-CSF congelada de la etapa (c) hasta una temperatura dentro del intervalo de 2°C a 8°C a lo largo de un período de tiempo ajustado para permitir que la composición se descongele y para obtener una composición líquida que tenga un contenido de G-CSF de al menos 95% del contenido de G-CSF de la composición proporcionada en la etapa (a).

2. El método según la reivindicación 1, en el que la cantidad de G-CSF en la composición de G-CSF tamponada de la etapa (a) está en el Intervalo de ,25 mg/ml a 6,5 mg/ml.

3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la composición de G-CSF tamponada tiene un pH de 3,5 a 5, preferiblemente de 3,7 a 4,8.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la concentración de acetato o glutamato de la composición de G-CSF tamponada está en el Intervalo de ,5 mM a 1 mM, preferiblemente de 2 mM a 8 mM.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cantidad de sorbitol en la composición de G-CSF está en el intervalo de 1 a 1 mg/ml, preferiblemente de 25 a 75 mg/ml.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la composición acuosa de G-CSF tamponada con acetato o glutamato proporcionada en la etapa (a) tiene un volumen de 1 mi a 4 I y más preferiblemente de 1 mi a 1,5 I.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la composición de G-CSF se enfría en la etapa (b) hasta una temperatura de entre -15°C y -25°C o una temperatura de entre -6°C y -8°C.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la composición de G-CSF congelada se almacena en la etapa (c) a lo largo de un período de al menos tres meses.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el Incremento de temperatura de la composición de G-CSF congelada hasta una temperatura dentro del intervalo de 2°C a 8°C se efectúa en la etapa (d) incrementando gradualmente o linealmente la temperatura a lo largo de un período de tiempo de al menos 6 horas.

1. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el incremento de temperatura de la composición de G-CSF congelada hasta una temperatura se efectúa en la etapa (d) llevando la composición congelada hasta una temperatura dentro del intervalo de 2°C a 8°C y manteniendo la composición a dicha temperatura durante un período de tiempo de al menos 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas y más preferiblemente al menos 36 horas.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, en el que la composición de G-CSF está libre de tensioactivo.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, en el que la composición de G-CSF comprende un tensioactivo.

13. Un método para proporcionar una composición farmacéutica de G-CSF humano recombinante no glicosilado, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) formular G-CSF humano recombinante no glicosilado con un tampón de acetato o glutamato y sorbitol para obtener una composición acuosa tamponada de G-CSF, en donde la cantidad de G-CSF está en el intervalo de ,1 mg/ml a 8, mg/ml y en donde dicha composición tiene un volumen de 1 mi a 8 I;

(b) enfriar la composición de G-CSF de la etapa (a) hasta una temperatura de -15°C o menos para obtener una composición de G-CSF congelada;

(c) almacenar la composición de G-CSF obtenida en la etapa (b) en estado congelado a lo largo de un período de al menos un mes;

(d) incrementar la temperatura de la composición de G-CSF congelada de la etapa (c) hasta una temperatura dentro del intervalo de 2°C a 8°C a lo largo de un período de tiempo ajustado para permitir que la

composición se descongele y para obtener una composición líquida que tenga un contenido de G-CSF de al

menos 95% del contenido de G-CSF de la composición proporcionada en la etapa (a); y

(e) cargar la composición líquida obtenida en la etapa (d) en envases primarlos para uso parenteral.